草酸降解菌的筛选及其对猫草酸钙结石预防效果的研究

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尿石症是猫临床常见的泌尿道疾病,其发病数约占猫尿路疾病的15%-23%。尿石症的结石种类主要包括:草酸钙结石、磷酸铵镁结石、胱氨酸、黄嘌呤、血凝块等。其中猫尿石症中最常见的两种结石类型为鸟粪石和草酸钙结石。与其他结石不同的是,草酸钙结石质地坚硬,只能通过外科手术方式进行治疗,且复发率较高,不仅给动物带来了身体上的痛苦,也给宠主带来了精神和经济上的压力。因此我们迫切需要寻找一种预防猫草酸钙结石的方法。草酸的产生主要包括外源性食物摄入和内源性肝脏代谢产生,由于猫的体内缺乏可以降解草酸的酶,草酸的代谢途径主要通过消化道和泌尿道。因此增加消化道排泄草酸的浓度,进而降低泌尿道排泄草酸的浓度,减少草酸钙结晶或结石的形成,从而有效预防草酸钙结石的发生。研究发现,肠道菌群与肥胖、冠心病、高血压等多种代谢病存在关系,但对于预防草酸钙结石方面的研究较少。因此,本文通过分离猫粪便细菌和筛选实验室已存在的益生菌两种途径,筛选出可降解的草酸的细菌,并建立小鼠草酸钙结石的模型和猫的食源性高草酸模型,验证筛选菌在猫体内预防草酸钙结石的效果。试验1:草酸降解细菌的筛选通过参考大量文献资料,我们对有乳酸菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌三个种类共计15株细菌进行草酸降解菌的筛选。试验分别使用MRS培养基,粪肠球菌培养基和TSB培养基进行培养,并在培养基中加入10 mmol/L草酸钠,制成筛选降解草酸细菌的培养基。将细菌接种于培养基中,记录细菌在筛选培养基中12h生长曲线。经过两天37℃恒温培养,使用草酸根离子检测试剂盒检测筛选培养基中剩余草酸浓度,计算得每株细菌降解草酸的效率,从而筛选得到2株可有效降解草酸的细菌,它们分别为一株植物乳杆菌和一株枯草芽孢杆菌,这2株细菌将用于后续试验。试验2:草酸降解菌对草酸钙结石小鼠模型的预防效果及浓度安全性的探究以10周龄雄性昆明小鼠为试验动物,通过腹腔注射80 mg/kg乙醛酸诱导建立小鼠草酸钙结石模型,并灌服菌液探究试验1筛选所得的2株细菌在小鼠体内对草酸钙结石形成作用的影响。试验期间记录各组小鼠每天记录体重变化,绘制体重变化趋势图。28天后处理所有小鼠,收集相关样本用于后续实验分析。试验结果显示,植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的试验使用浓度均不影响小鼠的正常生命体征,说明试验使用菌液浓度为安全浓度。通过对所有试验组进行血液学分析发现,植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌均可有效降低小鼠血肌酐、尿素氮和血草酸浓度,保证了小鼠肾脏功能的正常。小鼠肾脏病理组织切片结果表明,与结石模型组小鼠肾脏相比,细菌干预组小鼠的肾脏损伤减轻、结晶数量减少,说明植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌均可有效影响小鼠草酸钙结石的形成,减少草酸钙结石对肾脏的损伤。由于草酸钙结石会造成肾脏组织的氧化应激反应,因此我们检测了小鼠肾脏组织的氧化应激损伤指标:总超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,结果表明与结石模型组相比,植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌都可以有效缓解草酸钙结石引起肾脏组织的氧化应激反应。因此,通过对小鼠草酸钙结石模型饲喂试验1中的菌液,可确定植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌均可有效预防小鼠草酸钙结石的形成,预防效果基本相同且使用安全且无明显副作用。试验3:猫食源性摄入过多草酸模型的建立与细菌预防草酸钙结石效果的探究通过在猫饲料中加入饲料重量1%草酸钠建立猫食源性摄入过多草酸模型,每日记录所有试验组猫的体重,绘制体重变化趋势图。试验结束后对所有试验猫进行临床检查:血肌酐、尿素氮和血草酸的检测,尿沉渣镜检,对猫肾脏、膀胱进行多普勒超声检查。根据试验2中所得出的结论,我们使用了试验2中菌液浓度饲喂试验3中的细菌干预组,血液学结果表明,与试验2结果相似,植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌均可有效降低猫血肌酐、尿素氮和血草酸浓度,且使用浓度均不降低猫的体重,对猫无明显毒副作用。超声检查发现,模型组肾脏回声明显升高,肾脏轮廓不光滑,膀胱内有大量泥沙状高回声物质。细菌干预组内肾脏回声轻微升高或者正常,肾脏轮廓和大小正常,膀胱内无或有少量泥沙状高回声物质。通过收集猫的尿液检查尿沉渣发现,模型组内可见大量草酸钙结晶,细菌干预组内无结晶或者存在少量。因此,植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌均可有效预防猫食源性摄入过多草酸引起的草酸钙结石。综上所述,植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌均可预防小鼠和猫的草酸钙结石,且作用效果基本相同,因此试验结果提示我们枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌均有望成为预防猫草酸钙结石的潜在药物。
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