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实验背景：经济的快速发展不断地提高着国民的生活水平，与之相伴随的是逐年升高的冠心病发病率，如何有效预防及治疗冠心病已然成为心血管领域的研究热点之一。微创介入技术的引入使得缺血心肌及时再灌注成为可能，为冠心病的治疗带来新希望；但是再灌注本身诱发的心肌损伤却成为制约冠心病疗效的瓶颈。Notch广泛表达于哺乳动物的各组织器官中，是动物进化过程中非常保守的一种基因，我们所关注的心血管系统中也有表达。研究发现，Notch1不但能够影响胚胎期心脏的发育，而且与成年期动物的心血管系统疾病密切相关，例如酒精性心肌病、心梗及心肌肥大。动物实验表明Notch1可调节成年动物心肌组织中的保护性分子信号通路；而抑制Notch1激活则会大大增加处于应激状态心脏的损伤。另外，最新的研究报道称，Notch1能够通过增加超氧化物歧化酶的表达来抑制氧化应激反应并进而降低肝脏的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤。但是目前，Notch1信号通路对心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion, MI/R)损伤的影响却并不清楚。本研究将通过动物实验阐明Notch1信号通路在MI/R中的作用并探讨其相关的机制，为防治冠心病提供新的理论基础。实验目的：1.建立心肌Notch1活性降低的小鼠模型；并观察Notch1对MI/R损伤的影响；2.明确氧化/硝化应激在Notch1信号减轻MI/R损伤中的作用；3.研究Notch1是否介导了TNF-抑制剂的抗MI/R损伤作用并探讨其相关的机制。实验方法：1.心肌Notch1活性下调或上调小鼠模型的建立：利用2%异氟烷挥发性麻药麻醉小鼠并固定于操作台上，经其左侧胸骨的第4、5肋间将心脏暴露，然后給予20μg Notch1siRNA或Scrambled siRNA心肌点注射，制备心肌Notch1信号活性降低的小鼠模型；另外，利用同样操作方法，給予Jagged1(Notch配体，12μg)或PBS心肌点注射，制备心肌Notch1信号活性升高的小鼠模型；2.小鼠MI/R模型的制备：待心肌行点注射48小时后，通过结扎/再通小鼠的心脏冠脉左前降支来建立MI/R损伤动物模型，给予30分钟的缺血处理，于再灌前10分钟分别给予各对应组生理盐水、EUK134(ONOO-清除剂，5mg/kg, i.p.)、Etanercept(TNF-抑制剂，8mg/kg, i.p.)；3.缺血心肌再灌注3小时之后，(1)利用Caspase-3试剂盒检测心肌组织中Caspase-3活性水平，利用TUNEL染色技术测定心肌细胞凋亡水平；(2)利用Western blots方法检测心肌组织中Notch1ICD、gp91phox、iNOS、eNOS/peNOS、Akt/pAkt及PTEN等的表达水平；(3)根据DHE染色和光泽精发光法的原理流程来测定小鼠心肌组织中的超氧阴离子含量；(4)以NO2-和NO3-代表NO水平，根据Griess反应原理利用NO检测试剂盒测定心肌组织中的NO含量；(5)根据免疫组化和ELISA法的操作流程来检测小鼠心肌组织中硝基酪氨酸含量；(6)利用透射电镜直观观察小鼠心肌线粒体形态变化情况；(7)利用ATP试剂盒与JC-1试剂盒的原理及操作流程来检测心肌线粒体功能(ATP含量与线粒体膜电位水平)；4.缺血心肌再灌注24小时后，(1)利用小动物超声检测系统来测定小鼠心脏的功能；(2)测定完心功能后重新结扎冠脉左前降支，再根据Evans blue/TTC双重染色的流程来测定小鼠的心肌梗死面积；5.缺血心肌再灌注2周后，给予没有处理的小鼠重新测定心功能，而后根据马松染色的操作流程检测小鼠心肌纤维化程度。实验结果：1.将Notch1胞内活性片段(Notch1intracellular domain, Notch1ICD)的检测水平作为评估Notch1siRNA或Jagged1心肌点注射效率的指标。与正常MI/R小鼠相比，Notch1siRNA干预小鼠心肌组织中Notch1ICD水平明显下降，降低幅度达到45.23%；Jagged1干预小鼠心肌组织中Notch1ICD水平明显升高，升高幅度达到77.07%。2.与正常MI/R组相比，再灌注3小时后：Notch1活性降低小鼠心肌组织中TUNEL染色的绿色阳性细胞数目增多，Caspase-3的活性水平升高，表明心肌细胞凋亡水平升高；心肌线粒体结构破坏，ATP生成减少，膜电位降低，表明亚细胞器损伤加重；gp91phox、超氧阴离子、iNOS、NO、硝基酪氨酸及PTEN生成均增加，表明氧化/硝化应激水平增加；相反，eNOS及Akt磷酸化水平均降低，表明保护性信号被抑制。再灌注24小时后，Notch1活性降低的小鼠的心肌梗死面积明显增加，心功能明显降低。再灌注2周后，Notch1活性降低的小鼠的心肌纤维化水平明显增加，心功能也进一步降低。3.再灌注前10分钟給予EUK134，Notch1信号降低的小鼠心肌中的线粒体损伤减轻、细胞凋亡水平降低、梗死面积减少、心功能得到改善，表明EUK134能够逆转Notch1活性的降低所诱导的心肌损伤；同时，EUK134能够减少Notch1活性降低的小鼠心肌中硝基酪氨酸的水平，表明EUK134能够降低心肌组织的硝化应激水平。4.与正常MI/R小鼠相比，Jagged1干预小鼠的心肌线粒体损伤减轻、细胞凋亡水平明显降低、梗死面积减少、心功能得到改善，表明Jagged1能够减轻MI/R损伤；同时，心肌组织中Notch1ICD及eNOS磷酸化水平均升高，而超氧阴离子、iNOS、NO及硝基酪氨酸水平均降低，表明Jagged1能够通过激活Notch1信号通路抑制氧化硝化应激并进而降低MI/R损伤。5.再灌注前10分钟給予Etanercept，I/R心肌中的线粒体损伤减轻、细胞凋亡水平明显降低、梗死面积减少、心功能显著地改善，表明TNF-抑制剂能够减轻MI/R损伤；同时，心肌组织中的gp91phox、超氧阴离子、iNOS、NO及硝基酪氨酸含量均降低，表明TNF-抑制剂能够降低心肌组织中的氧化/硝化应激水平。而心肌Notch1信号活性的降低能够消除Etanercept的心肌保护作用，并能够增加心肌组织中的氧化/硝化应激水平，表明Notch1部分介导了TNF-抑制剂的心肌保护作用。实验结论：1. I/R损伤能够激活心肌组织中的Notch1信号通路；而内源性Notch1信号在促进心肌细胞存活、抑制心肌纤维化及维持心功能等方面发挥着重要的作用；2. Notch1部分通过PTEN/Akt信号通路的抗氧化/硝化应激作用来减轻MI/R损伤；3. TNF-抑制剂能够激活心肌组织中的Notch1信号；而Notch1的抗氧化/硝化应激机制部分介导了TNF-抑制剂的抗MI/R损伤作用。