肾性贫血不仅影响着患者的生活质量，还是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者并发心血管疾病的独立危险因素，可加速CKD进展，增加患者住院率和死亡率。现有标准治疗方案红细胞生成刺激剂(Erythropoiesis stimulating agents，ESAs)+铁剂，因其使用时产生超高的血浆促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)水平会诱发高血压、心衰、中风和心梗等心血管不良反应以及这些不良反应导致的死亡率增加；加之，ESAs需要注射治疗、价格昂贵等因素，主要的治疗人群为即将透析的CKD患者和已经透析的肾衰竭患者，CKD5期前进行ESAs治疗的患者极少。因此，肾性贫血仍有较大的临床需求未被满足。低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶(Hypoxia inducible factor-Prolyl hydroxylase domain，HIF-PHD)抑制剂通过多种效应促进红细胞生成，包括促进内源性EPO生成、改善铁代谢和提高造血细胞对EPO的反应性等，降低了治疗肾性贫血所需的EPO水平，可避免高EPO浓度导致的心血管不良反应。此外，HIF-PHD抑制剂是小分子口服药物，服用方便、费用低，依从性好，能更广泛应用于CKD3-4期的贫血患者。已有的试验结果也显示其有较好的治疗效果和安全性，有望能克服现有治疗方案的不足，替代现有治疗方案。
　　目的：本课题通过建立成熟稳定的药效筛选体系，包括细胞及动物的体内外实验平台，进行HIF-PHD抑制剂临床前药效研究，筛选出在体外活性及体内药效与参比化合物Roxadutat(又名FG-4592)相当或更优的HIF-PHD抑制剂。结合药代动力学和毒理初步评价，以及化学方面的考量，确定一个候选化合物，然后对候选化合物进行全面的体内外药效学验证。
　　内容：本课题主要包括两部分内容：第一部分是HIF-PHD抑制剂的体内外筛选评价。在本部分内容中，首先建立化合物对Hep3B细胞EPO分泌影响实验，对合成的全新化合物进行细胞活性筛选，筛选出EPO分泌活性、细胞毒性及化合物溶解性达标的化合物进行大鼠药物代谢动力学(Pharmacokinetics，PK)评价；然后将PK参数达标的化合物在ICR小鼠中单次给药后，测试血浆EPO浓度变化，考察体内药理活性；最后对体内活性较好的化合物，结合化学方面的考量，选择部分化合物进行大鼠、犬14或28天毒理评价，筛选出候选化合物。第二部分是候选化合物DS015的体内外药效学验证。在本部分内容中，分别从体外和体内两个方面对DS015进行药效学评价。体外实验包括DS015对HIF-PHD酶的亲和力测试，对Hep3B细胞EPO转录及分泌的影响，以及对炎症因子(TNF-α和IL-1β)抑制Hep3B细胞分泌EPO的影响。体内实验中，分别采用健康食蟹猴和大鼠肾性贫血模型进行考察，在正常食蟹猴中评价了DS015对外周血EPO和红系指标的影响，在肾性贫血模型中，分别采用5/6肾切除、庆大霉素和顺铂诱导大鼠肾性贫血模型考察DS015的治疗作用。
　　结果：第一部分：HIF-PHD抑制剂的体内外筛选评价。通过Hep3B细胞EPO分泌实验，从27个化合物中筛选出了4个化合物细胞活性较好，这些化合物促进Hep3B细胞分泌的EPO最大浓度与FG-4592相当或更好，EC50在FG-4592EC50的3倍以内，且这部分化合物的溶解性较好，对Hep3B细胞毒性低。再经大鼠PK测试后，化合物DS015的PK参数相对较好，其大鼠口服5mg/kg剂量后Cmax(峰浓度)为18400ng/mL，AUClast(0-∞时刻药时曲线下面积)为38400h*ng/mL，生物利用度(F)为81.47%，半衰期(T1/2)为4.2h；表观分布容积(Vss)为0.234L/kg，不倾向于分布到组织中。之后测试DS015对ICR小鼠体内EPO分泌的影响，其在36、120、360μmol/kg剂量下小鼠血浆EPO浓度为202.34±56.64、581.14±128.39、5249.80±1045.02pg/mL(溶媒组血浆EPO为153.23±18.31pg/mL)，有较好的剂量依赖性，与同剂量下FG-4592的EPO水平(324.43~10071.30pg/mL)相近。另外，还对DS015进行大鼠、犬毒理考察，经过毒理试验初步评价，DS015与参比化合物FG-4592毒性表现相近，DS015大鼠28天毒理试验无明显毒性反应剂量(No Observed Adverse Effect Level，NOAEL)为25mg/kg，FG-4592大鼠14天毒理试验NOAEL为15mg/kg；犬14天毒理试验发现，DS01575mg/kg剂量下毒性明显比FG-459250mg/kg剂量轻，最终确定将DS015作为候选化合物开展后续的药效学验证。第二部分：化合物DS015的体内外药效学验证。体外HIF-PHD酶活性测试表明，DS015在HIF-PHD1/2/3酶三个亚型上均有较强的抑制活性，对应的IC50值分别为0.11、0.42、0.043μΜ，活性略优于FG-4592，在三个酶上的选择性与FG-4592相似。在Hep3B细胞EPO转录及分泌活性实验中，DS015可浓度依赖性的促进EPO转录和分泌，起效浓度为0.93μΜ，活性略优于FG-4592；同样在化合物对炎症因子抑制Hep3B细胞EPO分泌影响实验中，DS015能逆转炎症因子对EPO分泌的抑制作用，起效浓度为0.93μΜ，且活性略优于FG-4592。体内实验也证实，DS015在健康动物和肾性贫血模型中均表现出较好的药效活性。健康食蟹猴中，单次给予DS015(30~60mg/kg)，可明显升高血浆EPO水平，连续给予DS015(20~80mg/kg)四周后，可观察到外周血红系指标剂量依赖性地身高，起效剂量为20mg/kg。大鼠肾性贫血模型的药效研究也表明，在5/6肾切除大鼠贫血模型中，DS015(8~16mg/kg)每天给药一次，连续给药四周，可以剂量依赖性地改善模型大鼠的贫血症状，起效剂量为8mg/kg；在庆大霉素诱导大鼠贫血模型中，DS015(5~12mg/kg)每天给药一次，连续给药两周，12mg/kg剂量下，可明显升高模型动物血红蛋白(HGB)水平；在顺铂诱导大鼠肾性贫血中，DS015(8~20mg/kg)每周给药3次，连续给药四周，可剂量依赖性显著改善模型大鼠贫血症状，起效剂量为8mg/kg。
　　结论：本课题针对HIF-PHD靶点机制及肾性贫血适应症建立了一系列的体内外药效评价方法。首先通过体内外EPO活性测试、药代动力学评价和毒理试验从27个化合物中筛选出了候选化合物DS015。然后对DS015进行全面的体内外药效学验证，体外酶学和细胞活性上，DS015活性略优于FG-4592，体内肾性贫血模型治疗实验表明，DS015每天给药1次和每周给药3次均可达到较好的治疗效果，起效剂量为8mg/kg，具有较好的开发潜力。