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一研究背景
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一组原因不明的关节退行性疾病,其主要病理特征为关节软骨的破坏和骨赘形成。OA在世界各地广泛分布,无明显种族和地域差异,且发病率高,在63-70岁的人群中,出现影像学上膝关节OA的比例约为27%;而在80岁以上人群中,可增加至44%。OA已经成为我们所面临的严峻问题。
首先引起研究者关注的是肥胖的生物力学作用对OA的影响,当一个人在行走的过程中,通过膝关节的重量大约为体重的3-6倍,因此,肥胖者的体重不仅加重了承重关节的负荷,也增加了OA的发病风险。关节负荷在OA发病过程中起到了一定的作用,然而,这却难以解释非承重关节(如手关节)的OA表现。Dumond等首次在OA患者的关节液中发现了瘦素(Lp,leptin),且瘦素水平与体重指数密切相关,这意味着瘦素等代谢因素可能在OA的发病中起重要作用。
瘦素主要是由脂肪细胞分泌的循环激素,由ob基因编码的一种分泌型蛋白质,具有调节体重、神经内分泌、生育、免疫炎症反应与血管生成等。此外,瘦素在炎症反应中具有双重作用,一方面,它激活单核细胞/巨噬细胞,使其产生TNF—α、IL等炎性细胞因子,诱导T细胞分化为Th1细胞,表达干扰素;另一方面,它能够刺激IL-1受体拮抗剂等抗炎因子的释放。
为了了解瘦素在OA中的作用及可能机制,本研究进一步比较我国健康人群及OA患者的血清、滑液瘦素水平与西方国家的差异,观察瘦素在软骨细胞增殖和分泌功能中的作用,以期为阐明瘦素在国人OA中的发病机制提供新的思路,为治疗OA提供实验依据。
二目的
观测瘦素在中国健康人群及OA患者血清、关节液中的分布情况与西方国家是否有差异性,观察瘦素对软骨细胞的增殖及分泌功能的影响,初步推测瘦素可能与OA软骨退变及骨赘形成相关。
三方法
1、选择了60例原发性膝关节OA患者作为实验组,27例健康人作为对照组。受试者禁食>8h小时,清晨空腹抽取肘静脉血4ml,置于非抗凝试管内,37℃水浴40min,3000rmp·min-1离心10min,留上清;另外,严格无菌操作,抽取膝关节关节液2-5ml,置于肝素锂抗凝试管内,以3000rmp·min-1离心30min(4℃),留上清;将上清分装于无菌EP管中,封口,置于-70℃冰箱冻存备用,避免反复冻融。采用ELISA法(enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附法)测定瘦素、TNF-α的水平,按ELISA试剂盒说明书操作。
2、取正常人及OA患者的软骨、骨赘、滑膜标本,以10%福尔马林固定、石蜡包埋、切片、HE染色、光镜观察其病理改变,同时作瘦素、瘦素受体的免疫组织化学染色,观察它们在软骨组织中的表达水平。
3、取正常人及OA患者软骨标本,分离培养软骨细胞,传代并鉴定,然后加入0,10,50,100,500,1000 ng·mL-1不同浓度的瘦素进行培养,通过MTT法测定第1、3、5天的软骨细胞的增殖情况;并运用RT—PCR方法检测不同浓度的瘦素对软骨细胞的Ⅱ型胶原、TNF-α、TGF-β1 mRNA表达水平的影响。
4、所有数据均采用SPSS13.0软件统计包进行分析,连续性正态分布的资料以(x±s)表示,两组均数间比较采用T Test,多组均数间比较采用One—Way Anova,两组均数相关性分析采用简单线性相关,P<0.05为差异有统计学意义。
四结果
1、OA患者的血清瘦素水平高于正常人群,且OA患者关节液瘦素水平明显高于其血清(P<0.05);此外,轻、中、重度三组OA患者的关节液瘦素水平有明显的差异性,重度组明显高于轻、中度组;而轻、重度组OA患者的关节液TNF—α水平明显高于中度组(P<0.05);瘦素水平与TNF—α水平无相关性。
2、正常人及OA患者软骨的瘦素、瘦素受体免疫组织化学染色阳性,软骨陷窝处着色明显,呈棕黄色颗粒,软骨基质无着色,对照组染色阴性。
3、正常成人软骨细胞体外分离培养,数量较多,活性良好,细胞以梭形和三角形为多,细胞可传5代而无明显退变迹象;而OA患者软骨体外分离培养的细胞与正常人相比,数量较少,活性较差,增殖较慢,形态与正常软骨细胞相似。培养细胞经过甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定为软骨细胞。
4、低剂量的瘦素能促进软骨细胞增殖,以50ng·mL-1的浓度尤为明显;而高剂量的瘦素则抑制软骨细胞的增殖,以1000 ng·mL-1的浓度为明显;且低浓度的瘦素可以促进软骨细胞Ⅱ型前胶原、TGF—β1 mRNA合成,高浓度抑制,呈剂量依赖性;而不同浓度的瘦素均能增加软骨细胞TNF—α mRNA表达,无剂量依赖性。
五结论
瘦素在中国健康人群及OA患者血清、关节液中的分布与西方国家无明显差异。瘦素可能通过调节软骨细胞的增殖及Ⅱ型胶原、TGF—β1、TNF—α mRNA合成,参与了OA软骨退变及骨赘增生的发病过程。