论文部分内容阅读
在依赖于核糖体的蛋白质生物合成过程中,tRNA为行使接头分子的功能,必须在对应的氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS,E.C6.1.1)催化作用下于分子的3’末端加载氨基酸,形成蛋白质合成的原料氨基酰-tRNA。aaRS是一类古老的蛋白质,根据不同进化来源的结构特征的催化活性中心,20种aaRs被分为两类,每类有10种,而亮氨酰-tRNA合成酶(Leucyl-tRNA synthetase,LeuRS)属于第一类酶的a亚类。除ArgRS,GInRS和GIuRS是通过一步反应实现tRNA的氨基酰化,大部分aaRS催化的氨基酰化反应分为两步完成。第一步是氨基酸的活化反应:氨基酸攻击ATP的α-磷酸基团,产生被活化的中间体氨基酰-腺甘酸和焦磷酸;该反应又叫ATP-PPi交换反应(磷交换反应)。第二步是tRNA的氨基酰化反应:氨基酸被转移到tRNA的3’-末端腺苷酸的核糖的羟基上产生氨基酰-tRNA和AMP。进一步,氨基酰-tRNA被蛋白质翻译因子运载到核糖体,通过tRNA分子上的反密码子与mRNA上而的密码子进行碱基配对,依次通读每一个三联体密码。这种密码子-反密码子相互作用特异性地决定了蛋白质分子中氨基酸的序列位置。因此,蛋白质生物合成的质量控制主要取决于核糖体上密码子-反密码子碱基配对和tRNA的氨基酰化这两个过程。
为保证tRNA氨基酰化的精确性,aaRS必须从化学结构相似的氨基酸中特异性地识别对应的氨基酸,同时也必须从细胞内众多结构相似的tRNA中特异性地识别对应的tRNA。aaRS要做到正确识别对应氨基酸,防止错误识别非对应氨基酸并将错误率控制在蛋白质生物合成可以接受的水平(约为10-4),主要通过两类机制:优先结合对应氨基酸并对相似氨基酸进行筛选性编校。而aaRS特异性识别对应的tRNA,主要取决于tRNA分子上的识别元件能否被aaRS分子上对应的结构元件识别。
三界生物的tRNALeu与tRNASer,tRNASec以及原核类tRNATyr的可变茎环都是由多于10个核苷酸组成,它们一起构成第二类tRNA;而其余的tRNA的可变茎环仅由5~6个核苷酸组成,统称为第一类RNA。在tRNALeu的氨基酰化过程中,由于细胞内存在许多与亮氨酸侧链结构十分相似的氨基酸,LeuRS很难将亮氨酸与相似氨基酸区分开来,因而在进化过程中LeuRS通过基因融合获得了具有水解活力的含编校活性中心的结构域以阻止tRNALeu的误氨基酰化。在整个编校过程中离不开tRNALeu的参与,tRNALeu3’末端在合成活性中心和编校活性中心之间的“穿梭”转位是发挥编校功能的关键步骤。尽管不同系统来源的tRNALeu的识别元件各不相同,但是辨别子A73和三级碱基对是它们的主要识别元件。
tRNALeu的识别元件能否表现正确的动态构象从而被LeuRS对应的结构元件最为有效地识别,对于精确合成亮氨酰-tRNA乃至蛋白质至关重要。而表现的动态构象主要决定于在毫秒级的tRNALeu分子构象变化。我们利用核磁共振波谱学(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)技术,研究了E.coli tRNALeu的热稳定性,并通过测定镁离子依赖的碱基对中的亚氨基质子与水分子中氢原子交换的速率,重点对毫秒级tRNALeu的构象变化进行了分析。结果表明,E.coli tRNALeu(CAG)的热稳定性随着镁离子浓度和pH值的升高而增加。而在[Mg2+]/[tRNALeu]从1增加到5,10和15的过程中,tRNALeu各个碱基对构象变化的转变趋势和转变步骤都各不相同。其中,在与后续生化功能实验结果对应的[Mg2+]/[tRNALeu]由10增加到15的过程中,只有接受茎5’末端前三位碱基对中亚氨基质子与水分子中氢原子交换的速率(均为毫秒级)显著增加;而相应地,反映稳定性变化的接受茎前三位碱基对的自山能变化的差值均为负值。这就表明接受茎5’末端前三位碱基对的构象变化加剧,局部结构变得灵活。进一步,通过酶活力测定实验和NMR滴定实验,我们研究了大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) tRNALeu的毫秒级构象变化对LeuRS氨基酰化与编校反应的影响。结果表明,LeuRS氨基酰化活力受镁离子依赖的E.coli tRNALeu毫秒级构象变化的影响,而转移后编校活力基本不受影响。接受茎5’末端前3对碱基对在这一过程中发挥重要作用并且CCA末端在大多数时间内指向编校活性中心。