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目的临床许多疾病都可导致局灶性脑缺血的发生。脑缺血后引起的病理生理过程复杂，可出现神经元的变性、坏死、迟发性神经元死亡和/或凋亡，进而引发不同程度的运动、语言及认知功能障碍等神经系统后遗症。神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，可促进神经元的分化，维持神经元的生长、发育，参与受损神经元的修复。降钙素基因相关肽(CGRP)是第一个利用基因重组技术发现的由37个氨基酸组成的活性多肽，有强烈的舒张血管效应，可预防和缓解脑血管痉挛。脑缺血再灌注损伤过程中，有多种相关基因被诱导和表达，如P38MAPK、CHOP及IL-1β等，这些基因的过表达可能诱导或加速神经元的凋亡。脑缺血再灌注损伤后，外源性NGF和CGRP是否对P38MAPK、CHOP及IL-1β的表达有调节作用尚未见报道。因此，本研究通过线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，检测缺血神经元P38MAPK、CHOP及IL-1β三个基因表达变化，旨在探讨NGF和CGRP是否对P38MAPK、CHOP及IL-1β的表达有调节作用，为进一步探索缺血性脑血管疾病的发病机理及脑保护药物的研发奠定基础。方法1、实验动物健康雄性Wistar大鼠210只，体重250-280g，由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为5组：假手术组(sham组，10只)；缺血再灌注组(I/R组)；NGF治疗组；CGRP治疗组；NGF&CGRP治疗组。其中I/R组、NGF组、CGRP组、NGF&CGRP组在局灶性脑缺血2h后又分为再灌注3h、12h、24h、48h、72h组。每组每个时间点动物10只(6只用于组织化学及原位杂交化学染色，4只用于Western Blot分析)。2、局灶性脑缺血再灌注模型的制备大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(350mg／kg体重)，取颈部正中切口，分离结扎右颈外动脉、右颈总动脉，分离右颈内动脉，将涂有硅酮直径0.28mm的尼龙线从右侧颈总动脉与右颈内动脉之间的切口小心插入右颈内动脉内(18.0±1.0)mm，即暂时阻断右侧大脑中动脉，造成大鼠右侧脑局灶性缺血，外留栓线10mm，固定栓线，缝合皮肤。缺血2h后再次麻醉动物，轻轻拔出栓线约1mm，实现再灌注(由对侧的颈内动脉和椎动脉供血)。对照组除不插栓线、不注射药物外，其余步骤同上。再灌注开始前经左颈外动脉插入套管针至左颈内动脉内备用。缺血再灌注组：缺血2h后，拔出栓线约1cm，实现再灌注。同时，用微量注药泵(D-34209，德国贝朗公司)经左颈外动脉向颈总动脉内缓慢注射生理盐水1ml，30min内注射完毕；NGF组：注入NGF1ml(500U／ml，大连司威特公司)，30min内注射完毕；CGRP组：注入CGRP1ml(1μg／1ml，美国Sigma公司)，30min内注射完毕；NGF&CGRP合用组：注入NGF和CGRP 1ml(含NGF500U，CGRP1μg)，30min内注射完。注射完毕后结扎左颈外动脉。按照Longa 5级评分法评分。评分标准：0分：无神经损伤症状；1分：提尾不能完全伸展对侧前爪；2分：向内侧转圈；3分：行走时向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。以麻醉清醒后评分1、2、3分的大鼠认为模型制作成功，纳入实验组。3、HE、TTC染色观察皮质组织病理学改变冰冻切片经室温自然凉干，常规HE染色、TTC染色。显微镜下观察假手术组和缺血再灌注组大鼠皮质组织病理变化以及梗塞灶的部位和范围。4、固定、取材及原位杂交化学和免疫组织化学染色用10％的水合氯醛(350mg／kg体重)腹腔注射麻醉动物，快速开胸暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，用肝素生理盐水快速冲洗至清澈，再用含4％多聚甲醛的0.1mol／L PBS(含／1000DEPC)灌注，断头取脑，在两耳极连线前6mm、后10mm处，分别冠状切开脑组织。组织块置于同样的灌注液中固定2h，然后蒸馏水充分洗涤，30％蔗糖溶液4℃过夜沉底后，冰冻切片机(LEICA CM1850，Germany)连续冠状切片，片厚20μm，—20℃储存，用于原位杂交化学和免疫组织化学染色。5、蛋白质提取及蛋白印迹分析10％的水合氯醛(350mg／kg体重)腹腔注射麻醉动物，断头取脑。剪碎脑组织置于裂解液中机械匀浆，4℃15000rpm离心1h，取出上清液，弃去沉淀。用考马斯亮蓝G250结合法，根据已知牛血清白蛋白溶液的浓度及其吸光度和样品吸光度，计算样品蛋白浓度。将各组蛋白浓度调至同一水平，SDS-PAGE电泳分离。转移至硝酸纤维素膜，ECL化学发光法检测皮质神经元内P38MAPK、CHOP及IL-1β蛋白的表达。6、图像分析及数据统计应用Metamorph图像分析系统和Bio 2RAD Gel 2000光密度扫描仪进行光密度扫描测定，计算平均光密度值(Mean optical density，MOD)和整合光密度值(Integral density volume，IDV)。所得数据以(?)±s表示，用SPSS11.5软件进行方差分析和t检验，P＜0.05为差异有显著性。结果1、大鼠脑皮质组织病理学改变HE染色观察，假手术组神经元数量多，排列整齐，形态较完整；缺血再灌注组神经元肿胀，分布不均，细胞周围间隙增宽，部分细胞体积缩小，核固缩深染；大鼠局灶性脑缺血24h后，TTC染色出现明显的梗塞灶，而假手术组没有观察到梗塞灶。2、P38MAPK mRNA原位杂交检测结果假手术组皮质神经元内P38MAPK mRNA有少量表达；缺血再灌注3h后，缺血侧皮质神经元P38MAPK mRNA的表达上升，至12h达高峰，以后逐渐下降，至72h仍高于对照组。光镜下反应产物呈棕黄色，主要表达于细胞浆内。在各相应时间点，I／R组P38MAPK mRNA阳性产物的MOD值高于假手术组(P＜0.01)；也分别高于NGF组和CGRP组(P＜0.05)；NG&FCGRP合用组P38MAPK mRNA阳性产物的MOD值分别低于NGF组和CGRP组(P＜0.05)。3、P38MAPK蛋白检测结果免疫组织化学染色显示：光镜下免疫反应产物呈棕黄色，主要表达于细胞核，细胞浆内也有少量表达。在假手术组皮质神经元内，P38MAPK蛋白有少量表达；在缺血组，随着缺血再灌注时间的延长，P38MAPK蛋白表达的量逐渐增多，于再灌注24h达高峰，以后逐渐下降。I／R组P38MAPK蛋白阳性产物的MOD值在各时间点明显高于假手术组(P＜0.01)；NGF组和CGRP组P38MAPK MOD值在各时间点明显低于I／R组(P＜0.05)；NGF&CGRP合用组MOD值分别低于NGF组和CGRP组(P＜0.05)。蛋白印迹分析显示：在相同时间点I／R组P38MAPK蛋白印迹条带IDV值高于假手术组(P＜0.01)，也分别高于NGF组和CGRP组(P＜0.01)；NGF组和CGRP组P38MAPK蛋白印迹条带IDV值高于NGF&CGRP合用组(P＜0.05)。4、CHOP mRNA原位杂交检测结果光镜下CHOP mRNA反应产物呈棕黄色，主要表达于细胞浆内。在假手术组皮质神经元内未见CHOP mRNA表达；在缺血组，随着缺血再灌注时间的延长，CHOP mRNA的表达逐渐上升，至24h达高峰。以后逐渐下降，至72h趋于对照组。除3h，72h外，I／R组阳性产物的MOD值高于假手术组(P＜0.01)；NGF组和CGRP组CHOP mRNA阳性产物的MOD值低于I／R组(P＜0.05)；NGF&CGRP合用组CHOP mRNA阳性产物的MOD值分别低于NGF组和CGRP组(P＜0.05)。5、CHOP蛋白检测结果免疫组织化学染色显示：光镜下免疫反应产物呈棕黄色，主要表达于细胞核，细胞浆内也有少量表达。在假手术组皮质神经元内未见CHOP蛋白表达；在缺血组，随着缺血再灌注时间的延长，其表达的量逐渐增多，于再灌注24h达高峰，以后逐渐下降。I／R组CHOP蛋白阳性产物的MOD值在各时间点明显高于假手术组(P＜0.01)；NGF组和CGRP组CHOP蛋白阳性产物的MOD值在各时间点明显低于缺血再灌注组(P＜0.01)；NGF&CGRP合用组MOD值低于NGF组和CGRP组(P＜0.01)。蛋白印迹分析显示：在相同时间点I／R组CHOP蛋白印迹条带IDV值高于假手术组(P＜0.01)，也分别高于NGF组和CGRP组(P＜0.01)；NGF组和CGRP组CHOP蛋白印迹条带IDV值高于NGF&CGRP合用组(P＜0.01)。6、IL-1βmRNA原位杂交检测结果光镜下IL-1βmRNA反应产物呈棕黄色，主要表达于细胞浆内。在假手术组皮质神经元内未见IL-1βmRNA表达；在缺血组，随着缺血再灌注时间的延长，IL-1βmRNA表达明显上调，至24h后达高峰。I／R组IL-1βmRNA阳性产物的MOD值在各时间点明显高于假手术组(P＜0.05)；NGF组和CGRP组IL-1βmRNA阳性产物的MOD值低于I／R组(P＜0.05)；NGF&CGRP合用组IL-1βmRNA阳性产物的MOD值分别低于NGF组和CGRP组(P＜0.05)。7、IL-1β蛋白检测结果免疫组织化学染色显示：光镜下免疫反应产物呈棕黄色，主要在细胞浆内表达。在假手术组皮质神经元内未见IL-1β蛋白表达；缺血再灌注后，随着时间的延长，IL-1β蛋白表达的量逐渐增多，于再灌注后48h达高峰，72h后开始下降。I／R组IL-1β蛋白阳性产物的MOD值在各时间点明显高于假手术组(P＜0.01)；NGF组和CGRP组IL-1β蛋白阳性产物的MOD值在各时间点明显低于缺血再灌注组(P＜0.05)；NGF&CGRP合用组MOD值分别低于NGF组和CGRP组(P＜0.05)。蛋白印迹分析显示：在相同时间点I／R组IL-1β蛋白印迹条带IDV值高于假手术组(P＜0.01)，也分别高于NGF组和CGRP组(P＜0.01)组；NGF组和CGRP组IL-1β蛋白印迹条带IDV值高于NGF&CGRP合用组(P＜0.05)。结论1．脑缺血再灌注后P38MAPK、CHOP、IL-1βmRNA及其蛋白表达上调，P38MAPK、CHOP、IL-1β参与脑缺血再灌注后神经元的凋亡。2．NGF和CGRP分别下调P38MAPK、CHOP、IL-1βmRNA及其蛋白表达，提示P38MAPK、CHOP、IL-1β分别是NGF和CGRP的作用靶点，这可能是二者对缺血神经元起保护和恢复作用的分子机制之一。3．NGF和CGRP合用对P38MAPK、CHOP、IL-1β的调节作用更强，二者对缺血神经元恢复有协同作用。