论文部分内容阅读
目的:microRNAs作为近年来发现的一种内源性非编码小分子RNA,可参与细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动。miR-200b是miR-200家族的成员之一,在恶性程度高的乳腺癌细胞中低表达,在恶性程度低的乳腺癌细胞中高表达。岩藻糖基转移酶4(FUT4)是编码糖复合物糖链岩藻糖化的酶蛋白,催化L-fucose从GDP-fucose转移至相应受体上形成α-1,3糖苷键。FUT4在乳腺癌细胞中高表达,促进乳腺癌细胞发生EMT,和乳腺癌细胞增殖、转移潜能呈正相关。本研究将探讨miR-200b与FUT4的关系,探讨其是否靶向FUT4并是否通过PI3K/Akt信号通路影响乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖,迁移和侵袭功能,探讨miR-200b能否成为乳腺癌诊断和治疗的新靶点。方法:1.miR-200b,FUT4在乳腺癌中的表达(1)采用实时荧光定量PCR技术、免疫组织化学染色技术检测乳腺癌组织中miR-200b,FUT4的表达。(2)将miR-200b模拟物(miR-200b mimics)转染进入乳腺癌细胞MCF-7中,利用实时荧光定量PCR技术,Western blot,细胞免疫荧光实验检测miR-200b,FUT4的表达变化。2.miR-200b对FUT4的靶向调节作用(1)利用TargetScan,PicTar等软件预测miR-200b与FUT4的结合位点,初步预测FUT4是否为miR-200b的候选靶基因。(2)将miR-200b mimics转染至乳腺癌细胞MCF-7中,增加miR-200b的表达水平,并利用实时荧光定量PCR检测miR-200b,FUT4的表达变化,Western blot检测FUT4在蛋白水平的变化。(3)构建fut43’-非翻译区(3’-utr)的psi-check-2载体(psi-check-2-fut4-3’utr),与mir-200bmimics共同转染进入mcf-7细胞内,采用双荧光素酶基因报告实验检测fut4荧光素酶活性的变化。3.mir-200b对乳腺癌细胞mcf-7增殖,迁移和侵袭功能的影响(1)将mir-200bmimics转染入mcf-7细胞内,通过cck-8实验以及平板克隆形成实验检测mir-200b对细胞增殖能力的影响。(2)将mir-200bmimics转染入mcf-7细胞内,采用细胞划痕实验检测mir-200b对细胞迁移能力的影响。(3)将mir-200bmimics转染入mcf-7细胞内,利用transwell体外细胞侵袭实验检测mir-200b对细胞侵袭能力的影响。4.mir-200b通过调节fut4的表达对pi3k/akt信号通路的影响转染mir-200bmimics进入mcf-7细胞后,通过westernblot检测细胞内fut4及pi3k/akt信号通路中相关分子的变化。结果:1.上调mcf-7细胞中mir-200b的表达导致fut4表达下降采用lipofectamine2000转染mir-200bmimics进入mcf-7细胞,实时荧光定量pcr结果发现mcf-7细胞中mir-200b表达增加,fut4表达降低;westernblot结果发现fut4在蛋白水平表达降低;细胞免疫荧光实验结果也表明转染mir-200bmimics后,fut4在蛋白水平表达下调。2.fut4是mir-200b的靶基因通过软件预测,fut4有可能成为mir-200b的候选靶基因,两者之间存在互补结合位点,将构建的含有fut43’-非翻译区的psi-check-2-fut4-3’utr与mir-200bmimics共同转染进入mcf-7细胞内,通过双荧光素酶基因报告实验发现,与转染scramblemimics的对照组比较,mir-200b抑制了转染报告基因的mcf-7细胞中fut4的荧光素酶活性,表明fut4是mir-200b的靶基因。3.mir-200b对mcf-7细胞增殖,迁移和侵袭功能的影响(1)cck-8细胞增殖实验和平板克隆形成实验结果显示,上调mcf-7细胞内mir-200b的表达水平,与对照组相比,该组细胞的增殖能力和克隆形成能力减弱。(2)细胞划痕实验表明,转染mir-200bmimics后,mcf-7细胞的迁移能力与对照组相比减弱。(3)Transwell体外细胞侵袭实验结果表明,MCF-7细胞中miR-200b表达上调后,细胞的侵袭能力与对照组相比减弱。4.miR-200b通过调节FUT4的表达对PI3K/Akt信号通路的影响上调MCF-7细胞中miR-200b的表达水平后,发现FUT4的表达下降,PI3K/Akt信号通路中p-PI3K、p-PDK、p-Akt(ser473)分子的表达均下调,与miR-200b表达增强后细胞增殖,迁移和侵袭能力减弱相一致。结论:1.通过双荧光素酶基因报告实验表明FUT4是mi R-200b的靶基因。2.上调MCF-7细胞中miR-200b的表达水平,细胞的增殖,迁移和侵袭能力减弱,表明miR-200b可影响乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能。3.在乳腺癌细胞MCF-7中,miR-200b可以调节FUT4的表达水平,并可能通过PI3K/Akt信号通路影响细胞增殖,迁移和侵袭功能。4.miR-200b通过调节FUT4的表达而影响乳腺癌细胞MCF-7的增殖,迁移和侵袭等生物学行为,可能成为乳腺癌诊断、治疗的新靶点。