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萜类化合物数量众多,结构多样,普遍存在于植物和微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还有助于进一步研究其在药物、香精等方面的应用。以本实验室前期初步实验结果(ADS的C末端6个氨基酸截短活性下降)为基础,利用软件对催化机制不同的三种倍半萜合酶进行比较,在相应位置进行截短,明确C末端保留几个氨基酸能够保留其原有活性,以探讨此效应是否有普遍性,具体工作如下:1.为探讨C末端对倍半萜环化酶功能的影响,我们选择对黄花蒿紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)C末端进行点突变,取纯化后的蛋白在相同酶浓度下对相同浓度底物进行体外催化,催化生成的产物经GC-FID分析,同时用MG法测定酶动力学参数Km和Kcat,发现:C1-C10截短不改变酶催化生成的产物,C1-C6截短从酶动力学参数上来看,其活性没有明显变化,C7-C10活性降低,没有用此方法测出动力学参数。2.为探讨C末端对非环化倍半萜合酶功能的影响,我们选择对非环化酶法呢烯合酶((E)-β-farnesene,BFS)C末端进行点突变,取纯化后的蛋白在相同酶浓度下对相同浓度底物进行体外催化,催化生成的产物经GC-FID分析,同时用MG法测定酶动力学参数Km和Kcat,发现:C1-C10截短不改变酶催化生成的产物,C1-C6截短从酶动力学参数上来看,其活性没有明显变化,C7-C10活性降低,没有用此方法测出动力学参数。3.为探讨C末端对反式倍半萜环化酶功能的影响,我们选择反式环化酶烟草马兜铃烯合酶(5-epi-aristolochene synthase,EAS)C末端进行点突变,取纯化后的蛋白在相同酶浓度下对相同浓度底物进行体外催化,催化生成的产物经GC-FID分析,同时用MG法测定酶动力学参数Km和Kcat,发现:C1-C10截短不改变酶催化生成的产物,C1-C6截短从酶动力学参数上来看,其活性没有明显变化,C7-C10活性降低,没有用此方法测出动力学参数。结合三种倍半萜合酶的结构信息,我们发现三种酶C末端1-10个氨基酸的截短不会改变产物,α螺旋上的氨基酸会降低酶活性,而α螺旋以外的氨基酸的截短与野生型相比,在活性上没有明显变化。