猪胚胎骨骼肌中基因间长非编码RNA的鉴定、特征及功能的初步分析

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猪胚胎骨骼肌的发育对肌肉的生长速度和肉质都具有重要的作用。现阶段对猪的胚胎骨骼肌的研究主要集中在蛋白编码基因和小非编码RNA上,而对长非编码RNA的研究较少。此前的研究表明长非编码RNA对肌肉的发育和分化也具有重要作用。本文利用RNA测序技术首次系统的在猪的胚胎骨骼肌中鉴定了基因间长非编码RNA并对其分子特征进行了分析。此外对一个物种间保守的基因间长非编码RNA的功能进行了分析,主要研究结果如下:1RNA测序得到的reads经过tophat比对基因组和cufflinks组装后一共得到54550条转录本,经过我们的过滤流程最终得到570条lincRNA,其对应于476个基因座。这些lincRNA的平均长度为1043bp,平均外显子数为2.5个,其中只有两个外显子的lincRNA的比例达到了65.7%。lincRNA的平均FPKM值为12,其中低于15的占到了总数的91.2%。除了Y染色体,lincRNA在不同的染色体上都有分布。经过BLASTN比对后,有28条猪lincRNA能在人lincRNA找到orthologs,有6条能在小鼠lincRNA找到orthologs (E value <10-5),分别只占到了其总数的5%和1.05%。猪lincRNA中无重复元件的数量占到了总数的35%,其中重复序列含量在80%以上的lincRNA占到了总数的1.76%。对lincRNA两侧蛋白编码基因的GO分析发现它们在涉及到在肌肉发育、转录调控等方面占有重要的比例。在随机挑选检测的10个lincRNA,有两个lincRNA在胚胎期的表达与成年期差异较大,要显著高于成年期的表达。这些结果表明猪的lincRNA转录本显现出一定比例的选择性剪接、较短的长度、较少的外显子、较低的表达量以及物种间的低保守性。大部分lincRNA并不是由重复序列所产生的,一定数量比例的lincRNA在肌肉发育和转录调控等方面可能具有重要的调节作用。2通过BLASTN比对,发现一个未知的lincRNA在猪、小鼠和人上都比较保守。猪上的这个保守lincRNA基因的两个转录本在猪胚胎期和成年期表达差异较大。小鼠上这个保守的lincRNA在ensemble数据库中有7个转录本,其中iso1、iso3、iso4这三个转录本在C2C12细胞的分化前后能检测到而且它们的表达差异也较大。通过3’RACE和RT-PCR发现iso1和iso4分别另有6个和2个转录本,这些转录本主要差别存在于它们的3’末端。Iso1和iso4的转录本小鼠胚胎期和成年期存在表达差异其中iso1-1的差异较大。对iso1和iso4的RNA干扰试验发现,iso1和iso4的小幅度下降导致了分化标记基因myog和MHC的表达下降了2.5倍左右,达到差异极显著(P <0.01),说明iso1和iso4的表达对C2C12细胞的分化有促进作用。Iso1和iso4主要表达于细胞核中,并且相对于IgG抗体能极显著的结合PRC2蛋白复合体(P <0.01)。3Iso1和iso4转录上游的启动子中存在3个CpG岛,其中CpG1-1、CpG2和CpG3岛在分化0天和5天都不存在甲基化位点,也没有甲基化差异。使用5-Aza-dc去甲基化试剂来处理分化0天的细胞后,iso1和iso4的表达量相对于阴性对照都极显著上升(P <0.01),表明DNA甲基化可能对iso1和iso4的表达具有调节作用。此外,iso1在低剂量(2uM)的5-Aza-dc就能显著上升,而iso4在高剂量(5uM)的5-Aza-dc才显著上升,说明iso1相对于iso4对5-Aza-dc的反应更为敏感,同时也暗示CpG1岛的甲基化程度对iso1和iso4的表达水平的影响程度也可能不一样。
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