【摘 要】
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僵蚕（Bombyx Batryticatus）为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant而致死的干燥体。文献考证要求僵蚕具有以下品质:“大而无蛆”“条直/条粗”“质硬”“折断腹内黑而光亮”。近年来,僵蚕的需求量逐年增加,市场上出现石灰水拌僵蚕、增重僵蚕、绿僵蚕、黄僵蚕、鼓炒僵蚕等
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僵蚕（Bombyx Batryticatus）为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuillant而致死的干燥体。文献考证要求僵蚕具有以下品质:“大而无蛆”“条直/条粗”“质硬”“折断腹内黑而光亮”。近年来,僵蚕的需求量逐年增加,市场上出现石灰水拌僵蚕、增重僵蚕、绿僵蚕、黄僵蚕、鼓炒僵蚕等伪品出售,造成市场混乱,影响临床用药的安全性与有效性。2015年版《中国药典》（一部）仅从杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分、黄曲霉毒素五项对僵蚕进行检查,难以达到有效地鉴别僵蚕真伪及评价其品质的目的。僵蚕的有效或药效成分尚未明确,其现代药理研究也不够深入,以致其质量标准不完善,无法保证临床药效,进而局限了对僵蚕资源的利用。蛋白质是僵蚕的主要成分之一,且具有种间特异性与稳定性,而目前关于僵蚕蛋白质仍鲜有研究与报道。本文旨在探究僵蚕碱溶性蛋白质的优化提取工艺,并以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及丙酮分级沉淀（AFP）/Tricine-SDS-PAGE技术研究僵蚕蛋白质组成,分析不同品质僵蚕的差异表达蛋白质分子,为挖掘僵蚕品质评价相关蛋白质分子标记及进一步阐明其品质形成的分子机制提供理论依据。本论文研究内容主要包括:1、建立僵蚕碱溶性蛋白质提取工艺。以0.1 M Tris-HCl缓冲液作为溶剂提取僵蚕蛋白质,考察Tris-HCl缓冲液p H、液料比、提取温度和提取时间对僵蚕蛋白质提取率的影响,寻找最佳的单因素水平。在此基础上,按照Box-Behnexn的中心实验组合实验设计原理,以4个单因素为自变量,僵蚕蛋白质的提取率为响应值,设计4因素3水平的响应面分析试验共29次试验。结果表明:最优提取条件为p H 8.0,液料比58:1（m L/g）,温度40℃,提取时间205 min,僵蚕蛋白质提取率为2.29%。2、建立并优化僵蚕蛋白质的SDS-PAGE指纹图谱。用0.1 M HAc-Na Ac缓冲液（p H 4.8）、0.1 M Tris-HCl缓冲液（p H 8.0）、H2O、40%Et OH溶剂提取选货与统货僵蚕蛋白质,利用SDS-PAGE分析不同品质的僵蚕蛋白质,考察蛋白质上样量、分离胶浓度和凝胶染色方法对其指纹图谱效果的影响,结果发现:酸溶、碱溶、水溶和醇溶蛋白质的最佳上样量为20μg,14%浓度的分离胶分析僵蚕蛋白质的效果最好,银染法较考马斯亮蓝染色法的灵敏度高,可以观察到更多的差异蛋白条带。3、挖掘选货与统货僵蚕中差异表达蛋白质分子,并对其进行LC-MS/MS及生物信息学分析。采用AFP/Tricine-SDS-PAGE法展示选货与统货僵蚕的差异表达蛋白质分子,对其进行LC-MS/MS鉴定,共计发现190个差异表达蛋白质,分布在细胞、细胞内和含蛋白质复合物,具有催化、抗氧化、离子结合和转运等功能,并且这些差异分子主要涉及了微生物代谢和碳代谢信号通路等,揭示上述分子及信号通路可能对僵蚕品质形成有重要影响,亦为建立基于专属性蛋白质分子标记的僵蚕品质评价技术提供重要参考及依据。
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