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植物在与病原微生物的自然竞争过程中,进化出两个层次的免疫系统来识别和防御病原物。第一层是由植物跨膜受体类蛋白识别病原物模式分子触发的免疫(PTI)。第二层是由植物抗病蛋白(R)识别病原菌的效应因子触发的免疫(ETI)。本课题组在水稻Piz-t基因克隆的基础上,图位克隆了其对应的稻瘟菌无毒基因AvrPiz-t,并利用酵母双杂交技术从水稻cDNA文库筛选到12个AvrPiz-t互作蛋白(APIPs),同时借助于核磁共振技术与合作实验室解析了AvrPiz-t的三维溶液结构。在此基础上,本文开展了对稻瘟菌无毒基因AvrPiz-t和水稻互作蛋白APIP12的研究,主要结果如下：1.利用已有的蛋白溶液结构信息,对AvrPiz-t预测的功能相关的氨基酸和表面分布的碱性氨基酸通过构建不同表达载体进行了突变,分别进行了功能互补,蛋白互作和亚细胞定位的研究。在／AvrPiz-t突变体转化稻瘟菌接种水稻的功能互补研究中,参与蛋白去泛素化的催化中心的H25A和N64A两个关键氨基酸突变都失去了无毒功能,而相邻的Q22A的突变不影响其无毒功能,表明催化中心的氨基酸对AvrPiz-t的功能非常重要。与12个APIP蛋白的酵母双杂互作研究中,C23A、H25A、A41V口C70A四个催化中心相关的氨基酸残基突变体与APIP2、APIP6和APIP10泛素化功能相关的互作都明显变弱或完全消失,进一步证明了AvrPiz-t的去泛素化活性中心氨基酸与泛素化蛋白的紧密联系。同时,在互补分析中未失去无毒功能的Q22A和D89A突变与12个APIP蛋白的互作也无明显变化,表明AvrPiz-t的功能与APIP蛋白的互作存在着正相关性。在亚细胞定位的研究中,AvrPiz-t在细胞中的位置与叶绿体重合,而氨基酸的突变基本不影响其亚细胞定位的变化。2.APIP12是AvrPiz-t在水稻中的互作蛋白,在N端和C端各有一个结构域与核孔蛋白Nup98同源,但不包含FG重复结构域,剩余序列在其它物种中找不到同源序列,因此APIP12可能是水稻的特有基因。我们通过酵母双杂和GSTPull-down验证了AvrPiz-t与APIP12的相互作用。水稻接种稻瘟菌后APIP12的表达都明显上调,表明APIPl2参与了水稻稻瘟病的抗病反应。水稻中花11的APIP12基因敲除突变体和日本晴APIP12 RNAi转基因系对稻瘟病的感病性增加,而且PR1O等基因在敲除系中的表达下降。在Piz-t水稻中敲除或过表达APIP12不会影响其对含AvrPiz-t稻瘟菌的抗病性,而且APIP12与Piz-t的LRR,NT和NBS结构域在酵母双杂实验中没有检测到互作,表明APIP12在Piz-t介导的抗病信号传导途径中并不重要。APIP12的位于细胞质中的未知结构内,但AvrPiz-t与APIP12共转化烟草时,AvrPiz-t能够与APIP12共定位,表明APIP12可能会与AvrPiz-t结合而改变其位置。APIP12与其它APIP蛋白中的APIP6和APIP8都能发生相互作用,因此这些APIP蛋白不是独立存在的,APIP之间也存在相互作用。综上所述,AvrPiz-t的蛋白结构预测的催化中心氨基酸突变后,都失去了无毒功能,其与水稻泛素化功能相关的蛋白互作也变弱或消失,证明了AvrPiz-t的功能可能与去泛素化相关。APIP12参与了水稻的基础抗性,但不参与Piz-t介导的对AvrPiz-t的抗病。