论文部分内容阅读
第一部分非酒精性脂肪肝患者肝功能损害与体内脂质过氧化水平的关系背景:非酒精性脂肪性肝病是一组与肥胖、胰岛素抵抗有关的疾病,氧化应激是其病情进展的关键因素。为进一步探讨肥胖,高血糖,高脂蛋白血症,氧应激这些因素对NAFLD患者肝细胞损伤的影响,我们拟对比分析健康者与NAFLD患者血清转氨酶的变化与MDA、GSH、GSSG以及糖脂代谢相关指标的关系,探讨脂质过氧化反应在NAFLD患者病情发展中的意义,以期对非酒精性脂肪性肝病的临床防治和机制探讨提供依据。方法:依据中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南诊断为非酒精性脂肪性肝病的患者89例,另选正常健康体检者30例为对照组。体检当天清晨空腹分别收集血清做ALT、AST、GGT水平检测以及测定血糖、血脂、身高、体重、腰围、臀围等指标参数,详细询问病史完成调查问卷,同时抽空腹血做GSH、GSSG及MDA水平检测,分析两组之间各指标的差异并对各指标与ALT、AST、GGT进行线性多元回归分析。结果:除年龄以及身高外,NAFLD患者与对照组的收缩压、舒张压、体重、BMI、腰围、臀围及腰臀比分别为:131.0899±16.06mmHg vs111.7667±9.6622mmHg,80.7865±10.7508mmHg vs72.1333±5.5939mmHg,27.4738±2.7044Kg/m~2 vs22.348±1.4957Kg/m~2,73.6067±10.1148Kg vs 60.6667±6.1214 Kg,0.9888±0.0675m vs 0.7497±0.0494m,1.3933±0.0606m vs 0.88±0.0585m,0.985±0.0364 vs 0.853±0.0197,各指标NAFLD患者均显著高于对照组(P＜0.05)。代谢指标的分析中,NAFLD患者平均空腹血糖水平为6.9204±2.3619mol/L,甘油三酯为2.1498±1.1454mmol/L,总胆固醇为4.9415±0.9635 mmol/L,低密度脂蛋白为2.7342±0.7426 mmol/L,脂肪酸为0.6481±0.1497mmol/L均显著高于对照组(分别为:4.703±0.5628mmol/L,1.1369±0.1712mmol/L,4.2047±0.3735mmol/L,2.1693±0.2936mmol/L,0.5193±0.1095mmol/L。P＜0.05),高密度脂蛋白为1.0488±0.1953 mmol/L,显著低于对照组1.374±0.0878mmol/L(P＜0.05)。肝功能分析结果显示NAFLD患者血清ALT、AST、GGT分别为55.8202±31.4638u/L,40.3258±25.947u/L及60.3933±50.9723u/L均明显高于对照组(分别为21.7667±6.447u/L,17.7333±3.805u/L,20.3±6.984,P＜0.05)。氧化应激指标结果显示,NAFLD患者血清中GSSG及MDA含量分别为44.5996±8.4965μmol/L及3.4401±0.6452μmol/L,比对照组26.4127±2.04μmol/L及2.2683±0.1016μmol/L明显升高(P＜0.05),而GSH为254.2137±35.9436μmol/L比正常对照320.3693±36.5549μmol/L显著降低(P＜0.05)。多元线性回归分析结果表明,在BMI、腰臀比、高血压、高血糖、高血脂及氧化应激水平等因素中,MDA、GSSG、GSH及GSH/GSSG对NAFLD患者血清转氨酶ALT、AST影响最明显,其中,GSH及GSH/GSSG与ALT、AST成负相关(P＜0.05)。对GGT影响最大的因素分别是GSSG和MDA(P＜0.05),GSH及GSH/GSSG对GGT的影响没有显著性(P＞0.05)。结论:NAFLD是一组与肥胖和血糖、血脂代谢紊乱有关的疾病,在NAFLD患者体内存在氧化/抗氧化稳态的失衡,并与肝细胞损伤密切相关。多元线性回归分析结果表明肥胖及血糖血脂异常虽然与NAFLD发病有关,但是脂质过氧化的水平才是对患者肝功能影响最大的因素。血清MDA、GSSG及GSH/GSSG水平的异常可能是反映NAFLD患者肝细胞受损的敏感的血清学指标。第二部分软脂酸钠体外诱导肝细胞内质网应激及细胞凋亡信号通路的体外实验背景:内质网应激由缺氧、营养缺乏、氧化应激、错误合成或未折叠的蛋白质增多等因素诱发,内质网应激发生后通过启动有关细胞信号转导途径抑制细胞蛋白合成,水解错误合成的蛋白,并对不能修复的细胞则通过内质网相关细胞凋亡机制诱导其凋亡以维持内环境稳态。研究证实过强和过长的内质网应激反应通过细胞能量耗竭、钙稳态失衡、激活内质网应激相关细胞凋亡等机制使器官和组织产生损伤,其中内质网应激相关细胞凋亡是应激状态下细胞损伤的主要机制。脂质过氧化是内质网应激的诱导因素,软脂酸钠可能通过诱导内质网应激造成肝细胞损伤、产生细胞凋亡。本部分研究拟通过软脂酸钠与人L02肝细胞体外共培养,诱导其产生脂肪变性建立非酒精性脂肪性肝病的细胞模型,分析饱和脂肪酸(软脂酸钠)体外对内质网应激的诱导情况和对肝细胞凋亡和损伤的影响,并探讨软脂酸钠诱导肝细胞内质网应激后细胞凋亡可能的信号途径。方法:以人正常肝细胞L02细胞系为实验对象,不加任何处理因素为正常对照组,用软脂酸钠处理L02细胞诱导其产生脂肪变性作为模型组,软脂酸钠及还原性谷胱甘肽联合处理为干预组。MTT法检测细胞活性,筛选软脂酸钠最佳作用浓度及时间,Annexin V/PI流式细胞仪定量检测细胞凋亡水平。同时检测细胞及细胞上清液GSSG以及MDA含量,评价脂质过氧化水平。RT-PCR分析软脂酸钠处理后L02细胞ATF4 mRNA变化趋势,western-blotting分析p-PERK、ATF4以及CHOP蛋白水平的变化,同时检测Caspase-4活性。并用还原性谷胱甘肽为还原剂观察干预脂质过氧化反应后上述模型相关指标的变化。结果:1、用软脂酸钠成功诱导建立L02肝细胞株脂肪变性模型。光镜下油红“o”染色显示,肝细胞可见大量橘红色脂滴,并随软脂酸钠浓度增加和时间延长而更加明显。2、与正常对照组比较,模型组培养上清的转氨酶(ALT、AST)水平及脂质过氧化(GSSG、MDA)水平明显升高,干预组的相应指标呈显著下降趋势(P＜0.05)。3、MTT及凋亡率检测结果发现,L02细胞暴露在不同浓度软脂酸钠中的时间越长,剂量越大,细胞凋亡越多,与正常对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。给予GSH干预后,可以观察到明显的细胞保护效应,L02细胞凋亡率明显下降(P＜0.05)。4、内质网应激信号及通路研究,在模型组,L02细胞GRP78蛋白水平明显增加,p-PERK水平在软脂酸钠处理12小时后开始升高,24小时达到高峰,ATF4 mRNA表达在软脂酸钠作用后2小时开始上调,12小时达到高峰,20小时以后开始下降,ATF4蛋白水平在24小时有所增加,与正常对照比较差异有统计学意义(P＜0.05)。虽然CHOP蛋白水平也有上升趋势,但是与正常对照组相比没有统计学意义(P＞0.05)。GSH干预后,GRP78蛋白、p-PERK水平、ATF4 mRNA及蛋白水平均明显下降(P＜0.05),CHOP蛋白水平也有下降趋势,但是差异没有显著性(P＞0.05)。在模型组,Caspase-4活性明显升高,加入GSH后则明显被抑制(P＜0.05)。结论:软脂酸钠诱导的脂肪变肝细胞内质网应激是介导非酒精性肝病肝细胞损伤的重要事件。软脂酸钠通过上调GRP78表达,启动内质网应激导致肝细胞凋亡。外源性补充抗氧化剂可以降低脂质过氧化反应,减轻内质网应激程度,减弱软脂酸钠对肝细胞的毒性。内质网应激细胞信号转导过程中,PERK-eIF-2α-ATF4-CHOP参与了脂肪变肝细胞内质网应激信号转导,而Caspase-4的活化可能是软脂酸钠诱导的L02内质网应激相关细胞凋亡的主要信号传导途径。