前言 胆囊癌是一种恶性度较高、早期诊断困难、转移发生早、对化疗不敏感、预后极差的消化道恶性肿瘤。在消化系统恶性肿瘤中，其发病率约占同期胆道外科病人的1～2％。近年来，随着外科手术技术的发展，胆囊癌的手术切除率已有了明显的提高，但由于胆囊癌早期诊断困难，起病隐匿，术后化疗效果不佳，其治疗效果近数十年来仍无明显的进展，术后5年生存率仅为5％～13％。鉴于胆囊癌的手术治疗效果仍不令人满意，近年来许多学者在深入进行胆囊癌的临床基础研究，不断改进手术方法的同时，积极探索综合治疗措施，其中对新的抗肿瘤药物的研究和探索已经成为胆囊癌治疗的热点。 外科手术后辅助化疗是预防大多数肿瘤复发的重要手段之一，但由于肿瘤对化疗药物的多药耐药(multidrug resistance)即MDR现象的存在，导致化疗失败，肿瘤复发。MDR是指肿瘤细胞对分子结构不同、作用机制各异的抗肿瘤药物产生交叉耐药。MDR是一种独特的广谱耐药现象，涉及到生物碱类、蒽环类、抗生素及放线菌素D等临床常用化疗药物。肿瘤细胞的耐药机制非常复杂，临床表现为耐药即可能是一种耐药机制起作用，也可能是多种耐药机制共同作用的结果。近年来研究表明，多药耐药基因(mdr-1)表达产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶-π(glutathione-S-transferase-π，GST-π)在肿瘤多药耐药方面发挥着重要的作用，而且两者作用机制不同。P-gp可由ATP功能发生能量依赖性变构，通过疏水区形成的通道主动将抗肿瘤药物泵至细胞外，使细胞内药物蓄积下降。P-gp在多种恶性肿瘤中高表达并与多种临床常见肿瘤的多药耐药表型相关，是肿瘤细胞产生耐药性的主要机理之一。胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)是一组具有多种生理功能的蛋白质，是参与机体解毒功能的超基因家族。许多外源性诱导剂或损伤性刺激均可引起细胞内GST异常表达，并参与对细胞的保护，维持细胞的正常功能，尤其是GST-π在人体多种肿瘤组织中表达并参与MDR的形成。 目前认为，MDR现象的产生及调节可能与体内有害化学物质及代谢产物的长期刺激，化疗药物诱导以及多基因调节效应有关。随着对MDR机制研究的深人，有学者发现许多肿瘤的m击一1基因表达产物P一gP及GsT一二的表达与多种癌基因及抑癌基因有关，如EGFR、。一erbB一、c一fos、c一my。、。-jun、ras、h价、bel-2、p53、nrn23等，尤其与p53的关系最为密切。但也有人认为MDR的形成与必3的作用无关。本实验应用免疫组织化学方法(SP法)对原发性胆囊癌组织中P一gP、GST一二和p53的表达进行检测，探讨其表达的相关性，并对其表达情况与胆囊癌生物学行为的关系及临床意义进行讨论。目的 本研究应用免疫组化染色方法(SP法)检测胆囊癌组织中P一gP，GST一二和p53的表达。探讨不同机制多药耐药相关蛋白的产生与p53蛋白表达的相关性及其临床意义。为探讨多药耐药相关机制、指导临床化疗和协助评价预后提供依据。实验材料与方法 一、实验材料 1.组织标本及临床资料 随机选取中国医科大学附属第一医院和第二医院1999年一2001年胆囊癌手术切除标本存档蜡块49例。其中，男24例，女25例，男性平均年龄(62.0士9.8)岁，女性平均年龄(54.5士9.3)岁。病理组织学类型均为腺癌;分化程度:高分化16例(32.7%)，中分化17例(34.7%)，低分化10例(20 .4%)，另外乳头状腺癌6例，占12 .2%;依据Nevin分期标准，临床分期:51、52、53期共19例(38.8%)，S4、S5期共30例(61.2%)。有淋巴结转移者27例(55.1%)，无淋巴结转移者22例(44.9%)。所有病例术前均未经放化疗及免疫治疗，术后所用病例诊断均经苏木素一伊红(IIE)染色病理证实。上述所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋。 2.主要试剂 鼠抗人P一gP、GST一二和p53单克隆抗体，SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均为福州迈新生物技术开发公司(M丽m Biotechnofogy，Inc.)产 口口口。 二、实验方法 1.免疫组织化学染色 将石蜡包埋的标本制成4叩厚的石蜡切片，丙酮固定10分钟后风干。脱蜡后3%HZO:甲醇液作用10分钟阻断内源性过氧化物酶活性;抗原热修复后降至室温水洗;10%正常羊血清室温作用30分钟;滴加即用型鼠抗人P一gP、GST一二和户3单克隆抗体，4℃冰箱湿盒内过夜;PBS冲洗三次，每次三分钟。滴加生物素标记的二抗，37℃孵育35分钟。PBS冲洗三次，每次三分钟。加人辣根标记链霉卵白素工作液，37℃孵育35分钟，PBS冲洗三次，每次三分钟。DAB显色3一5分钟，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶固定，封片。以0.olM PBS液(pH7.4)置换一抗作为阴性对照。以人结肠癌阳性切片作为P一gP阳性对照;以人食道鳞癌阳性切片作为GST一二阳性对照;以人胃癌阳性切片作为p53阳性对照。 2.染色结果判定 光镜下观察GST一二免疫组化染色以肿瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，P一gP以肿瘤细胞胞浆中或胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性细胞，p53为细胞核阳性。每张切片在400