孔雀石绿作为三苯甲烷类染料之一,广泛的运用在纺织印染工业中,由于其对鱼类水霉病等病害具有良好控制效果,在我国的水产养殖业中曾作为渔药长期使用。上世纪70年代以来,大量的报道证实孔雀石绿具有潜在的三致毒害作用,我国已将孔雀石绿列为水产养殖业中的禁用药物。但由于价格低廉、杀菌效果好等原因,仍有少量商贩违规使用。加之孔雀石绿在自然环境中残留期长、不易降解的原因,长期暴露在环境中的孔雀石绿迫切需要找到高效的降解方法进行降解。由于微生物降解作用范围广,降解效率高,同时可以原位修复等优点,是处理环境中孔雀石绿残留的有效手段。本文以三苯甲烷类染料孔雀石绿为研究对象,从江苏某水产养殖场采集底泥中驯化孔雀石绿降解菌群,运用高通量测序对这3代次的菌群进行了微生物群落区系变化分析,获得了与降解相关主要微生物信息,有目的的进行筛选,结合可培养的方式培养得到目的菌株JW3-6。并对该菌株进行降解条件的优化,以及对孔雀石绿的降解产物进行成分的测定,通过检测到的降解产物来推导出JW3-6降解孔雀石绿的可能的降解途径。本论文的主要研究结果概括如下:1、经过连续传代,富集物中的孔雀石绿浓度达到了300 mg/L,将每个代次的富集培养物分别命名为JW1、JW2和JW3,污泥样品命名为JWY,分别提取了4个样品的总DNA并进行了16S r V4-V5区扩增,运用Illumina Hiseq2500平台对构建的扩增子文库进行测序和OTU(Operational Taxonomic Units)物种注释。结果表明JW3在门水平上,降解菌群细菌主要分属于变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria);在纲水平上,降解菌群细菌主要分属于丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)、变形菌纲(Alphaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria);在属水平上,菌群主要分属于假单胞菌属(Pseudomonas)、双刃斧菌(Labrys)、不动杆菌菌属(Acinetobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基菌属(Methylobacillus)、不动杆菌菌属(Acinetobacter)、不动杆菌菌属(Acinetobacter)。发现假单胞菌Pseudomonas sp.为主要的优势菌群,在初始样品JWY中占总OTUS为0.93%,在JW3中占比增加为67.81%,而原本占总OTUs比仅为0.16%的双刃斧菌(Labrys),JW3中OTUs上升至14.6%,说明双刃斧菌(Labrys)也是参与孔雀石绿降解的主要菌群,此外不动杆菌菌属(Acinetobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus),经传代培养后OTUs占比逐渐升高,推测很可能与孔雀石绿的降解相关。2、根据富集培养高通量测序获得的菌种信息,选择富集样品JW3进行稀释涂布于含有100 mg/L孔雀石绿的MSM固体平板上,挑选形态不一样的菌落进行划线,并且以同样的平板多次划线纯化。最终筛选到8种可能具有降解孔雀石绿高效的降解菌株,其中以假单胞菌降解效率最高,结合可培养的方式培养得到目的菌株JW3-6,经初步鉴定与Pseudomonas veronii相似度为99.69%。3、对JW3-6降解菌降解孔雀石绿条件进行优化,设置不同梯度的温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃),pH(4、5、6、7、8、9),不同接种量(1×10~7,2×10~7,3×10~7,5×10~7,8×10~7,10×10~7 cfu/mL),研究不同条件对菌株JW3-6降解50 mg/L孔雀石绿能力的影响,以对不同初始浓度(20、50、100、150、200、250、300)mg/L的孔雀石绿的降解效率的影响。该菌7 d内对孔雀石绿降解率为91.2%。通过单因素试验确定了该菌最适的降解条件为30℃,pH 7,初始接种量5.0×10~7 cfu/mL,降解率最高达92.8%。4、JW3-6降解产物通过GC-MS技术进行产物定性分析,产物主要是隐性孔雀石绿、4-(二甲氨基)二苯甲酮、4-二甲氨基苯酚、苯甲醛、苯酚、对苯二酚。根据降解产物推测可能的降解途径为:孔雀石绿首先发生去甲基化还原反应生成隐性孔雀石绿,然后转化为4-(二甲氨基)二苯甲酮和4-二甲氨基苯酚,4-(二甲氨基)二苯甲酮进一步分解为苯甲醛和4-二甲氨基苯酚。4-二甲氨基苯酚进一步分解为二甲基苯胺及苯酚,后续逐步分解产物最终进入TCA循环。