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肿瘤转移基因(Metastasis-Associatde Protein,MTA)家族是一类重要的肿瘤转移相关基因,在生理和病理状态下均发挥作用,特别是与人类一些肿瘤侵袭转移关系密切。MTA3是其重要的组成成员之一,其定位于染色体2p21,含一个1548bp的可读框,编码515个氨基酸组成的蛋白质,分子量为65kd,主要参与组成具有核小体重塑活性和组蛋白去乙酰基酶复合物(Nucleosome remodeling andhistone deacetylation,NuRD),发挥基因转录调节作用。以往研究结果显示,在乳腺癌中MTA3的表达降低,使得其对snail的转录抑制作用下降,最终引起E-cadherin表达减少,癌细胞黏连减弱易于脱落形成转移,与肿瘤的侵袭及转移能力呈负相关,起到抑制肿瘤转移的功能。但在乳腺癌转移到肺部的转移癌中,与原发性肿瘤相反的是MTA3高水平表达,揭示了MTA3在转移癌中可能有着其他的表达影响因子,调节着其他的细胞信号途径。近期研究证实在小鼠初级颗粒细胞中,MTA3可以调控小鼠颗粒细胞从G2/M过渡,促进颗粒细胞的增殖,但具体机制没有报道。这就表明MTA3在不同肿瘤中发挥着不同的作用,但MTA3在肺癌中的表达及肺癌细胞中的生物学作用都未见报道。
我们之前的研究发现在肺癌细胞系中,转染反义MTA3可以降低肺癌细胞的增殖能力,因此,本研究检测了MTA3在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素之间的关系,并初步探讨了其对肺癌细胞凋亡功能的调节作用。
材料与方法
1、主要材料与试剂:
108例原发性NSCLC蜡块,标本来自2005年到2008年在中国医科大学附属第一医院实行手术的病人,患者术前均未接受放化疗。
细胞系:人肺腺癌细胞系A549,H157。
主要抗体:兔抗人MTA3多克隆抗体(1∶100,Proteintech,Chicago,IL,USA),鼠抗人Caspase-3多克隆抗体(1∶1000),鼠抗人Bax多克隆抗体(1∶1000),鼠抗人C-PARP多克隆抗体(1∶1000),鼠抗人Bcl-2多克隆抗体(1∶1000)以上均购于Cell Signaling Technologies, MA, USA。
相关试剂:
Trizol试剂购自Invitrogen公司,realtime-PCR试剂盒购自TAKARA公司,转染试剂:HiPerFect Transfection Reagent购自德国QIAGEN公司,SP检测试剂盒以及DAB酶底物显色试剂盒(DAB-0031)购自福州迈新生物技术公司。
2、实验方法:
(1)免疫组化SP法
按照福州迈新免疫组化实验试剂盒步骤进行
(2)细胞培养
将A549, H157细胞在含有10%胎牛血清的DMEM和1640培养基37℃,5%CO2孵箱孵育,1-2d换新鲜培养液。当细胞长满瓶底后,用0.25%胰酶消化,进行传代。
(3)瞬时转染
细胞培养后按照QIANGENE实验说明步骤进行
(4)细胞凋亡实验
(5) westemblot杂交
(6)提取细胞总RNA
(7) realtime-PCR
(8)统计分析
结果:
1、MTA3在非小细胞肺癌组织中高表达且与P-TNM分期、淋巴结转移及NSCLC患者预后相关
我们用免疫组化检测了MTA3在108例肺癌组织中的表达和联系,发现MTA3阳性信号主要定位于细胞核,在正常支气管中成阴性表达,随着p-TNM分期及淋巴结转移而表达增加。统计结果发现:MTA3的过表达与p-TNM分期、淋巴结转移及NSCLC患者不良预后呈正相关。
2、干扰内源性MTA3引起肺癌A549和H157细胞系早期凋亡增多及凋亡相关蛋白的变化
在高表达MTA3的肺癌A549和H157细胞系中干扰掉内源性MTA3的表达,发现凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、c-PARP表达明显增多,且细胞的早期凋亡百分率增加。
结论:
1、MTA3的过表达与非小细胞肺癌的P-TNM分期及淋巴结转移呈正相;与NSCLC患者的不良预后呈正相关。
2、干扰内源性MTA3可以引起凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、c-PARP表达明显增多,并促进肺癌细胞早期凋亡百分率的增加。