基因治疗是一种在核酸水平上治疗人类疾病的新兴技术,在过去几十年里,由于其具有靶向性强、毒副作用小等特征,成为当今生物医学领域的研究热点。目前基因载体主要分为病毒基因载体和非病毒基因载体。尽管病毒基因载体具有较高的基因转染效率,但是其安全性问题限制了它在临床治疗中的应用;而非病毒基因载体具有较好的生物相容性,但转染效率较低,因此开发新型的非病毒基因载体具有重要的研究意义和应用前景。阳离子聚类多肽是天然存在的聚多肤的结构类似物,即氮端取代的聚甘氨酸低聚物:它具有在生理环境下抵抗蛋白酶降解的特性,目前已成为非病毒基因载体的研究热点。聚类多肽已经应用于小分子探针、抗菌药物、药物递送等领域,但它还没有被广泛地应用于基因递送中,更为重要的是,没有系统地研究它在基因递送中结构与功能之间的关系。另外,基因转染过程中存在着多重屏障,单一的化学结构无法克服所有屏障而获得高效的基因转染效率。综上所述,本论文系统地研究聚类多肽的分子结构与基因转染之间的关系,并研究聚类多肽递送TNF-α siRNA介导基因沉默和治疗急性肝损伤的功效。本论文的研究工作分为以下两部分:一、聚类多肽分子结构对基因转染性能的研究通过NCA开环聚合与高效的“点击”化学反应合成并表征11种具有不同分子结构的聚类多肽,系统地研究其分子结构包括侧链末端带电基团的种类(季胺、叔胺、仲胺和伯胺)、聚合度(28、46、135和250)、三唑环与伯胺之间的距离(3、4、5和6个碳原子)及侧链疏水性修饰,与基因转染效率之间的关系。基因转染试验结果表明,侧链末端带电基团为伯胺的聚类多肽表现出较高的基因转染效率;聚合度为46的聚类多肽由于能够实现DNA包载与胞内释放的平衡,故表现出较高的基因转染效率;三唑环与伯胺之间的距离为6个碳原子的聚类多肽表现出较高的基因转染效率;侧链疏水性修饰的聚类多肽由于疏水组分增强膜融合能力,促进细胞摄取和内涵体逃逸,故表现出最高的基因转染效率。另外,聚类多肽在血清的环境下也可介导较高的基因转染效率。细胞内吞与胞内分布试验表明,聚类多肽可通过不同内吞途径进胞,并有效地逃逸内涵体。B16F10荷瘤小鼠瘤内注射转染试验结果聚类多肽表现出较高的转染效率,比商业试剂PEI-25k高出1-2个数量级。二、聚类多肽用于递送TNF-α siRNA治疗急性肝损伤的研究基于此,我们进一步研究了聚类多肽用于siRNA递送时其结构与功能的关系,筛选出聚合度为48、侧链末端带电基团为胍基及侧链疏水性修饰的聚类多肽,为最佳介导基因沉默效率的聚类多肽。另外,在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤小鼠模型中,聚类多肽/siRNA纳米复合物可高效地富集到肝脏组织,进而有效地抑制肝、脾、肺组织中TNF-αmRNA的表达,降低血清中TNF-α和IL-1β的含量,同时显著地降低肝脏中MPO和血清中AST/ALT的含量,显著提高小鼠的生存率,这些结果表明G4/TNF-α siRNA纳米复合物有效地缓解肝脏的炎症症状,达到治疗急性肝损伤的效果。根据以上结果可以得出,改变聚类多肽的分子结构可提高其基因转染和基因沉默效率,从而筛选出具有多功能的基团载体,同时表明其在生物医学上具有广泛的应用前景。