萜类化合物,又称类异戊二烯,是已知最大的一类次生代谢产物,从各类生物中发现的萜类物质有超过55000种。许多植物源的萜类化合物在植物与环境的相互作用中发挥重要功能。单萜、倍半萜和少数二萜、三萜分子量较小,具有较低的蒸气压,从而能够以气态形式被植物释放,是植物种群间、植物-昆虫间的重要化学信号媒介。本论文旨在系统地分析鉴定茶树倍半萜类挥发物种类、发掘茶树倍半萜类合成相关基因、明确倍半萜类合成酶功能,进而揭示倍半萜类物质代谢对各种胁迫的响应机制。本文以茶种Camellia sinensis(L.)O.Kuntze的普洱茶变种C.sinensis var.assamica和茶变种C.sinensis var.sinensis茶树花为材料,全面解析了茶树组成性萜类挥发物;通过非生物和生物胁迫处理,分析了茶树诱导性萜类挥发物。建立了2个茶树变种的花转录组和虫害诱导茶变种的叶片组织转录组数据库,发掘了茶树萜类MVA和MEP代谢途径的关键基因,验证了其功能。分离了10个茶树萜类合成酶,通过体外表达检测了其酶活性;以拟南芥为模式植物,转基因验证了茶树萜类合成酶基因1(CsTPS1)功能。比较了茶树对咀嚼式和刺吸式害虫为害的差异响应,初步证明了茉莉素(Jasmonates,JAs)是虫害诱导茶树萜类代谢的主导信号。具体研究结果如下:1、茶花是茶树组成性萜类物质生成的主要器官,普洱茶变种茶树花萜烯挥发物总量很大,包括约10种左右的单萜和27种倍半萜挥发物,其中倍半萜是主要萜烯产物,但茶变种茶树花萜类物质总量非常少,仅释放少量单萜,且主要是芳樟醇氧化物,基本无倍半萜产生。无论是种植在杭州的普洱茶变种茶树资源,还是分布在云南各地的同类种质资源,它们花中含有的萜类成分基本一致,不受环境等因素影响,这说明普洱茶变种和茶变种茶树花从表型和遗传上都显示了进化上的显著差异。生物和非生物胁迫能够诱导茶树释放萜烯挥发物,两者的诱导效应明显不同。虫害十分显著的诱导α-法尼烯α-farnesene和反式橙花叔醇trans-nerolidol,其中trans-nerolidol是其特异诱导萜烯挥发物。2、建立了虫害叶片转录组和茶花转录组数据库,通过从头测序(de novo)拼接发掘茶树萜类合成相关功能基因。获得10个全长茶树萜类合成酶基因,其蛋白一级结构显示8个成员是倍半萜合成酶基因,1个具有单萜合成酶特征,1个为双萜合成酶基因。分离了茶树萜烯MVA途径第一步限速酶HMGS的2个基因成员CsHMGR1-2,MEP途径第一步限速酶DXR的1个基因CsDXR。还注释了MEP途径的2个DXS基因,JAs信号途径作用元件相关基因COI1a-b、JAZ1-2、CsMYC2a-b等,以进一步研究茶树萜类代谢的信号调控机制。CsHMGR1能够被茶尺蠖和小绿叶蝉显著诱导,说明虫害能够诱导该基因表达,促进萜类物质生成。CsDXR在细菌中可以显著促进pAC-BETA质粒合成胡萝卜素,说明它具备合成萜烯前体物的功能。从虫害叶片转录组和茶花转录组中分离的萜类合成酶基因有序列上的同源性,有的同时存在于两个转录组中,有的则只在虫害诱导条件下表达,有的则仅在花中表达,负责花香中单萜和倍半萜挥发物的合成释放。3、本研究分离的这些茶树萜类合成酶基因,尽管它们都具有典型的植物萜类合成酶特征,但通过原核表达,酶活分析发现这些茶树TPS活性普遍很弱,仅能合成微量倍半萜。根据对普洱茶变种茶树花萜类挥发物的分析和其它植物TPS的研究经验判断,茶树的TPS可能在不同茶树变种之间产生功能分歧,这种进化导致来源于茶变种即小叶种茶树的TPS倍半萜合成能力退化或丢失。在小菜蛾为害处理下,茶树CsTPS1转基因拟南芥株系的长叶烯longifolene释放比野生型植株增加6-26倍,且抗虫性显著强于野生型拟南芥。分离了茶树三萜角鲨烯合成酶基因CsSQS,原核表达和酶活性分析显示,去除跨膜蛋白的突变CsSQS-mutant1可以缩合2分子FPP,生成角鲨烯squalene,并发现了1个茶花中含有大量角鲨烯的特异茶树资源。4、咀嚼式害虫茶尺蠖和刺吸式害虫小绿叶蝉对茶树萜烯挥发物的诱导效应不同,茶尺蠖能够诱导茶树释放出单萜3-蒈烯和倍半萜橙花叔醇,而叶蝉为害则不能诱导这2种萜类挥发物,说明咀嚼式害虫茶尺蠖对茶树萜烯的诱导作用更明显。当然虫害的诱导效应受茶树的树龄和生长状态、昆虫取食能力、环境因子等因素影响。HMGR的抑制剂洛伐他汀lovastatin处理茶苗,能够抑制虫害后茶树环长叶烯longicyclene和长叶烯longifolene这两种倍半萜的释放,证明体外信号的处理可以调控茶树萜烯代谢。用JAs信号抑制剂布洛芬Ibuprofen预先处理茶苗,同样能明显抑制虫害茶树环长叶烯longicyclene和长叶烯longifolene这两种倍半萜的释放,说明JAs是萜烯代谢的主导信号分子。