论文部分内容阅读
多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌紊乱性疾病,发病率为5%~10%,占不排卵妇女的75%-80%,它是一种高度异质性疾病,病理生理特征和临床表现具有多样性,发病机制至今未明。典型的临床表现有卵巢多囊性改变、不孕、肥胖、多毛和痤疮等,并常伴胰岛素抵抗和高脂血症。PCOS病理生理学改变极为广泛,涉及遗传学、内分泌、糖脂代谢、蛋白质代谢和卵巢局部调控因素等异常变化,是目前妇科内分泌领域研究的热点和难点问题。PCOS患者还易伴有糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌等远期并发症,严重影响了患者的心理健康和生活质量,对社会和家庭和谐带来了负面影响。目前该病多以内科治疗为主,几乎不采取手术治疗,收集临床标本来研究该病的发病机制和治疗策略非常困难,因此建立合适的大鼠模型,对PCOS的病因、发病机制及诊疗手段的研究极为重要。PCOS动物模型的建立方法有多种,大多数模型具有卵巢多囊状改变,但这些模型多是模拟PCOS某一或某几方面的病理特征,有些模型甚至出现与PCOS病理特征不符的现象,使得这些模型无法很好地应用于临床研究。本研究采用来曲唑灌胃法和脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)皮下注射法建立PCOS大鼠模型,针对PCOS的两大内分泌特征,分别从大鼠体重、卵巢的形态、卵巢的体积和相对质量、卵巢组织学变化、大鼠动情周期变化、大鼠性激素水平的变化和卵巢中受体蛋白的表达量等方面对两种PCOS大鼠模型进行评价,为PCOS的研究提供实验依据。目的本研究通过来曲唑灌胃法和DHEA皮下注射法建立PCOS大鼠模型,分别从大鼠体重、卵巢的形态、卵巢的体积和相对质量、卵巢组织学变化、大鼠动情周期变化、大鼠性激素水平的变化和卵巢中受体蛋白的表达量等方面对模型进行评价,以期为研究PCOS选择合适的大鼠模型。材料与方法1研究对象选取6周龄和23日龄清洁级雌性SD大鼠各60只,均随机分为实验组、实验对照组和空白对照组各20只,分别用于来曲唑造模法和DHEA造模法。2实验方法2.1饲养条件清洁级饲养,环境温度为20~24℃,湿度为40%-60%,每天光照10小时,自由饮水,喂以颗粒饲料。2.2来曲唑建模法实验组大鼠灌胃服用来曲唑1mg·(kg·d)-1,溶于1%羧甲基纤维素(Carboxy Methylated Cellulose,CMC)中,实验对照组大鼠灌胃服用1%CMC,均连续定时灌服20日,空白对照组正常饲养。2.3 DHEA建模法实验组大鼠背部皮下注射DHEA 6mg·(100g·d)-1溶于0.2ml甘油,实验对照组大鼠背部皮下注射0.2ml甘油,均连续皮下注射20曰,空白对照组正常饲养。2.4建模过程观察指标每日观察大鼠精神状态,并对各组大鼠进行阴道涂片后行巴氏染色,观察动情周期;每三日称量并记录大鼠体重,绘制大鼠体重增长曲线图。2.5标本的采集和处理第21日对所有大鼠称重后行乙醚麻醉,快速心脏取血法致死(对照组选取在其动情间期)。取血清置-20℃冻存备用,取出双侧卵巢称重后用游标卡尺测量其长度(A)、宽度(B)和厚度(C);一侧卵巢置于10%甲醛固定,另一侧卵巢用PBS冲洗后置-80℃冻存备用。2.6检测指标2.6.1卵巢体积和相对质量根据椭圆形体积计算公式V(mm3)=0.52×A×B×C计算大鼠卵巢体积;根据卵巢重量和大鼠体重计算卵巢相对质量,即质量(mg)/体重(g)×10-3。2.6.2卵巢组织学检查以大鼠卵巢最大平面为待检平面进行石蜡包埋,每个蜡块以4μm厚度切片两次,进行HE染色。2.6.3大鼠血清学检测应用放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)测定大鼠血清中促黄体生成激素(Luteinizing Hormone,LH)、卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)和睾酮(Testosterone,T)水平。2.6.4卵巢中受体蛋白检测应用免疫组化SP法检测大鼠卵巢中雄激素受体(Androgen receptor, AR)和黄体生成素受体(Luteinizing hormone receptors,LHR)定位表达;应用Western blot法检测各组大鼠卵巢中AR和LHR相对表达量。3统计学处理选用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,所有数据以x±s表示。计量资料两均数差异的比较采用方差齐性检验和独立样本的t检验,组内比较用单因素方差分析和多重比较中的LSD法,以a=0.05作为检验水准。结果1大鼠一般情况:各组大鼠建模过程中状态良好、反应灵敏、体毛润泽。2大鼠体重和动情周期的变化:①来曲唑法实验组大鼠体重增加量明显高于两对照组(P<0.05);实验组大鼠在灌胃12日后全部失去规律性动情周期,均处于动情间期时相。②DHEA法实验组大鼠体重增加量和对照组差异无统计学意义(P>0.05);实验组大鼠动情周期变化极不规律,至处死之日仍未完全失去规律性动情周期。③对照组大鼠保持规律的动情周期。3卵巢形态学、组织学、体积和相对质量变化:①来曲唑法实验组大鼠卵巢表面苍白、包膜增厚,可见大量囊状卵泡形成;组织学检查卵巢颗粒细胞层减至2-3层,间质细胞明显增生,卵泡内卵母细胞多数缺失,少见排卵前卵泡和黄体;实验组大鼠卵巢体积和相对质量明显大于两对照组(p<0.05)。②DHEA法实验组大鼠卵巢表面苍白,囊状卵泡凸起不明显;卵巢组织学检查可见颗粒细胞层减少和白膜增厚,但间质增生不明显;实验组大鼠卵巢体积明显小于两对照组(P<0.05),三组大鼠卵巢相对质量的差异无统计学意义(P>0.05)。③对照组大鼠卵巢颜色红润、表面光滑,颗粒细胞呈多层,可达8-9层。4大鼠性激素水平变化:①来曲唑法实验组大鼠血清LH、T浓度,LH/FSH显著高于两对照组,FSH、P、E2浓度显著低于两对照组(P<0.05);②DHEA法实验组大鼠血清T、E2浓度显著高于两对照组,血清FSH浓度明显低于两对照组(P<0.05),实验组大鼠血清中LH、P水平及LH/FSH与两对照组差别无统计学意义(P>0.05)。5大鼠卵巢中受体蛋白表达量:①来曲唑法实验组大鼠卵巢AR、LHR的表达量均明显高于两对照组(P<0.05)。②DHEA法实验组大鼠卵巢的AR表达量明显高于两对照组(P<0.05);三组大鼠卵巢中LHR的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论来曲唑法大鼠模型的病理特征较DHEA法大鼠模型与PCOS特征更为接近。