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人卵泡刺激素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是糖蛋白家族成员之一,该家族除了FSH外还包括黄体生成素(luteinizing hormone,LH),促甲状腺素(thyroid stimulating hormone,TSH),绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotrophin hormone,CG),它们都是异二聚体,包括非共价结合的α亚基和β亚基.α亚基在上述每一种激素中是相同的,是由同一基因编码的,而β亚基对于每一种激素是特异的,决定其抗原性和生物活性.hFSH在生殖过程中发挥重要作用,因其刺激排卵和生精的作用,FSH目前在临床上广泛应用于治疗不孕不育.该研究的主要目的是探索一种生产成本较低,活性更好的表达重组人卵泡刺激素的表达系统和方法.该论文的工作是进行人卵泡刺激素在昆虫细胞和巴斯德毕赤酵母细胞中的表达.首先我们是在昆虫细胞中表达重组人卵泡刺激素.我们以重叠PCR的方法,从人染色体DNA中扩增出hFSH β亚基的cDNA的编码区,将其克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVLl393,得到了表达载体pVLl393-hFSH β.将其与BaculoGoldTM线形杆状病毒DNA共转染昆虫细胞SF9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-hFSH β,然后将重组病毒感染昆虫细胞,得到在胞浆中表达的hFSH β亚基,Western blot显示分子量为2lkDa.最后以重组病毒AcNPV-hFSH β与AcNPV-hCG α一同感染昆虫细胞,得到具有分泌性的重组hFSH异源二聚体,Western blot显示分子量为33kDa.接着我们在巴斯德毕赤酵母中表达单链重组人卵泡刺激素.hFSH的两个亚基以非共价健相连,这种结合很不牢固,常常由于一些原因解离成单链,从而影响其活性.我们将两个亚基以共价方式结合起来形成单链结构,为了不影响其空间结构和活性,分别设计了两种连接物(CTP linker和GS linker),在巴斯德毕赤酵母中进行了单链重组人卵泡刺激素的表达.我们同样是利用重叠PCR的方法分别获得编码hFSHβ-CTP37-hCGα的cDNA和hFSHβ-GSlinker-hCGα的cDNA,将它们克隆入毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,分别得到表达载体pPIC9K/hFSHβ-CTP37-hCGα和pPIC9K/hFSHβ-GSlinker-hCGα.然后将这两个表达载体转入毕赤酵母细胞GSll5,得到了可以分泌到培养液中的单链重组人卵泡刺激素FSHCTP和FSHGS linker,Western blot显示分子量分别为43kDa和36kDa,后在摇瓶中培养表达量分别为468ng/ml和142ng/ml.