论文部分内容阅读
儿茶酚氧位甲基转移酶（Catechol-O-methyltransferase,COMT）为体内儿茶酚胺类递质以及某些药物如左旋多巴的重要代谢酶。人类COMT基因第4号外显子1947位点存在单核苷酸基因多态性现象,该位点基因多态性与某些神经精神疾病及妇科肿瘤的易感性有一定相关性,但结果尚存争议,可能原因是研究对象遗传背景不同。有关我国大陆汉族人群COMT1947位点基因多态性分布状况未见文献报道,尚有待于探明,为开展COMT1947位点基因多态性与某些疾病易感性以及药物治疗遗传差异性的相关性研究提供汉族人群遗传背景资料。COMT1947位点发生突变后,其编码的S-COMT一级结构发生改变,可能导致其酶活性变化。然而,目前有关COMT基因多态性与COMT酶活性关系的研究多局限于体外细胞模型上,且结果相矛盾。因此,有关人体COMT基因多态性对COMT酶活性的影响尚有待于探讨。左旋多巴（Levodopa,LD）目前仍是治疗帕金森病（Parkinson’s disease,PD）最常用的有效药物。COMT为LD的重要代谢酶。COMT基因多态性与LD药动学的相关性研究目前仅见Contin初步报道,该研究提示人体COMT基因多态性对LD药动学可能无明显影响。但该研究结论尚存争议,因其未测定不同基因型COMT酶活性,无法确定研究对象不同基因型COMT酶活性是否存在差异;此外,Contin研究未排除年龄、性别、肝肾功能状态等因素可能对LD药动学的影响。因此,COMT基因多态性对人体LD药动学的影响状况尚有待于探讨。LD起作用的靶部位是脑内纹状体,其在纹状体中药物浓度随时间变化规律目前尚不明确。为更深入了解LD治疗PD起效时间、维持疗效时间及临床一些不良反应如剂末效应产生原因,有必要开展LD在中枢特别是纹状体内药动学研究。临床要真正实现个体化给药遇到的最大难题是如何获得患者的药动学参数。而在获取群体药动学数据基础上采用Bayesian反馈法被认为是获得患者具体药动学参数最理想的方式。目前尚无国人的LD群体药动学资料,开展这方面研究,可为临床实现LD个体化给药提供重要的依据。基于以上存在问题,本文拟采用聚合酶链反应-限制性酶切片断长度多态性（PCR-RFLP）技术、高效液相色谱技术（HPLC）、脑微透析技术（Microdialysis）及非线性混合效应模型（NONMEM）法等多学科技术手段,首先探讨我国福建汉族人群COMT1947位点基因多态性分布状况并分析该位点基因多态性对COMT酶活性的影响;进而探讨COMT基因多态性对人体LD药动学的影响;本文尚从神经药动学角度探索大鼠纹状体细胞外液LD浓度随给药时间的变化规律;最后从群体药动学角度应用NONMEM法估算LD在帕金森病患者的清除率。通过上述研究,以明确我国大陆汉族人群COMT1947位点基因多态性分布状况,为开展其与某些疾病易感性以及药物治疗遗传差异性的相关性研究提供汉族人种相关的遗传背景资料;探明COMT基因多态性对人体LD药动学的影响,以及大鼠纹状体内LD浓度随给药时间的变化规律,为完善LD临床用药方案提供药动学实验依据;了解LD治疗PD的群体药动学参数,为临床实现LD个体化给药提供重要依据。一、我国福建汉族人群COMT1947位点基因多态性分布提取166名福建地区无血源关系的汉族健康志愿者白细胞DNA,PCR扩增目标片断,NIaⅢ限制性内切酶酶切PCR产物,酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色,根据酶切片断大小及个数判断对象COMT1947位点基因型,计算出该位点野生型（G/G）、杂合子型（G/A）和突变纯合子（A/A）在人群中的比例,并与其它民族、地区人群比较。结果显示,福建汉族人群COMT1947位点三种基因型G/G、G/A和A/A分布频率分别为58.4%、36.7%和4.9%。COMT1947位点等位基因频率G和A分别是77%和23%,其频率分布经卡方检验符合Hardy-Weinberg平衡定律,说明本研究人群具有一定的群体代表性。经与有关文献比较分析,本研究人群基因型分布和等位基因频率与肯尼亚人、日本人、韩国人及台湾地区汉族人群相似,差异无统计学意义（P＞0.05）;而与西亚人群及高加索人群如英国人、芬兰人和犹太人比较,具有显著差异（P＜0.01）,COMTG/G野生纯合子型比例显著高于西亚人群及高加索人群如英国人、芬兰人和犹太人（P＜0.01）,而COMT A/A突变纯合子型比例显著低于这些人群（P＜0.01）。以上结果提示,福建汉族人群COMT1947位点基因多态性分布不同于西亚及高加索人群,COMT1947位点基因多态性分布具有明显种族差异。二、COMT1947位点基因多态性对COMT酶活性的影响建立测定人体红细胞COMT酶活性的高效液相-电化学检测方法,测定166名志愿者红细胞COMT酶活性。经方法学考察,本研究所建立的测定红细胞COMT酶活性的高效液相-电化学检测方法准确、灵敏度高、重现性好,可满足测定需要。根据第一部分基因分型结果,比较不同基因型间COMT酶活性差异。结果表明,野生基因型（G/G）人体红细胞COMT酶平均活性为1.514±0.520pmol·mg-1·min-1（n=97）,杂合基因型（G/A）人体红细胞COMT酶平均活性为1.053±0.453 pmol·mg-1·min-1（n=61）,突变纯合基因型（A/A）人体红细胞COMT酶平均活性为0.625±0.247 pmol·mg-1·min-1（n=8）,三种基因型间COMT酶活性具有显著性差异（P＜0.01）,野生型（G/G）COMT酶活性最高,突变纯合子型（A/A）COMT酶活性最低,提示COMT基因多态性对人体COMT酶活性具有显著影响。三、COMT1947位点基因多态性对左旋多巴药动学的影响征集14名男性健康志愿者,其中野生基因型（G/G）5人、杂合基因型（G/A）5人、突变纯合基因型（A/A）4人,观察COMT基因多态性对人体左旋多巴药动学的影响。结果表明,参加药动学研究的杂合基因型组红细胞COMT酶活性(0.94±0.12 pmol·mg-1·min-1,n=5)显著高于突变纯合基因型组(0.54±0.15pmol·mg-1·min-1,n=4,P＜0.01),显著低于野生基因型组(2.04±0.30 pmol·mg-1·min-1,n=5,P＜0.01),即参加药动学研究对象中不同基因型间COMT活性存在显著差异。采用建立的高效液相.电化学法测定志愿者血浆LD浓度,血药浓度数据经3P87药动学软件分析显示,G/G、G/A和A/A三种基因型人体左旋多巴血药浓度均符合二室模型;三种基因型间t1/2β,AUC0-∞,CL/F,Cmax,tmax和V/F差异均未见统计学意义（P＞0.05）,提示COMT基因多态性对左旋多巴药动学可能无明显影响。四、大鼠左旋多巴纹状体神经药动学研究实验大鼠分LD合用苄丝肼组、单用LD组和生理盐水对照组,应用脑微透析技术采集大鼠纹状体细胞外液透析液,HPLC-ECD测定透析液中LD及其代谢物HVA浓度,同时采集外周血并测定血浆LD浓度,3P87药动学软件进行数据处理。结果表明,不管是LD合用苄丝肼组还是单用LD组大鼠,其纹状体细胞外液LD达峰时间(tmax)均显著慢于血浆LD达峰时间（相差约40 min）,达峰浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC0→∞)均远小于血浆达峰浓度和药时曲线下面积,而纹状体细胞外液LD消除半衰期与血浆相近。合用苄丝肼后大鼠纹状体细胞外液LD t1/2、Cmax和AUC0→∞显著大于单用LD,大鼠纹状体LD代谢产物HVA量也较单用LD明显增加,提示合用苄丝肼可显著减慢LD消除速度,提高LD进入中枢的量以及靶组织LD浓度。五、NONMEM法估算帕金森病患者左旋多巴清除率收集临床确诊PD患者41例,HPLC-ECD测定其LD血药浓度,应用NONMEM程序估算LD清除率,考察年龄、性别、体重、LD给药剂量及合并用其它抗PD药物对LD清除率影响。结果表明,年龄、性别、体重及合并用金刚烷胺、苯海索、吡贝地尔、培高利特和溴隐亭对LD的相对清除率无显著影响;而左旋多巴单位体重日剂量及合并用咪多吡可明显影响LD的相对清除率。清除率最终回归模型为:CL/F=（θ1·D+θ2）·θ3,表观分布容积最终回归模型为V/F=θ4·WT,其中θ1=1.81,θ2=0.012,θ3=17.4,θ4=0.40,D为左旋多巴单位体重日剂量,WT为体重。综上所述,本工作表明:1.首次报道了福建汉族人群COMT1947位点基因多态性分布状况,其基因型分布及等位基因频率不同于西亚人及高加索人,提示COMT基因多态性具有种族差异。2.首次报道汉族人群COMT不同基因型COMT酶活性存在显著差异,G/G基因型COMT酶活性显著高于A/A基因型,而G/A基因型COMT酶活性处于前两者之间,提示COMT基因多态性可影响COMT酶活性。3.COMT基因多态性对人体左旋多巴药动学未有明显影响。4.大鼠纹状体左旋多巴浓度随时间变化规律与血浆左旋多巴浓度随时间变化规律存在差异,前者达峰时间显著慢于后者,达峰浓度和药时曲线下面积均远小于后者,而两者消除半衰期相近。合用苄丝肼可显著减慢左旋多巴消除速度,提高左旋多巴进入中枢的量以及靶组织左旋多巴浓度。5.年龄、性别、体重及合并用金刚烷胺、苯海索、吡贝地尔、培高利特和溴隐亭对左旋多巴的相对清除率未有显著影响,而左旋多巴单位体重日剂量及合并用咪多吡可显著影响左旋多巴的相对清除率。