一.研究背景尽管在过去几十年中，烧伤的预防，治疗及康复有了长足的进步，但全身炎症反应引起的脓毒症和多器官功能障碍综合症依然是重度烧伤患者最重要的死亡原因。作为机体新陈代谢和免疫反应的核心，肝脏被认为是启动重度烧伤病人多器官功能衰竭的重要器官。炎性细胞因子如TNF-α和IL-1β被证明是烧伤早期最重要的细胞因子，同时，它们在引起肝细胞功能障碍过程中也起到重要作用。枯否细胞（KCS）是一种重度烧伤早期炎症因子释放的重要来源。KCs存在于肝血窦中，该部位含有人体内存在于固定组织中数量最庞大的巨噬细胞。研究表明，KCs在宿主的免疫反应引起的系统变化中起到关键作用，其作用表现在引起细胞因子释放和上调。通过早期研究，我们发现KCs是重度烧伤早期TNF-α和IL-1β释放的重要来源，并且导致了烧伤后的肝损伤。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种高度保守的非组蛋白染色体蛋白质，最初认为它是一种参与维护核小体结构和调节基因转录的DNA结合蛋白。但最新研究发现，HMGB1作为一种强有力的促炎性细胞因子和“晚期”炎症介质参与了全身炎症反应的发展。此外，人单核细胞培养纯化的重组HMGB1具有显著刺激细胞因子（如TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-6和IL-8）释放的功能。HMGB1不仅可通过损伤和坏死的细胞被动释放，还可以通过应激状态下的单核细胞和巨噬细胞主动分泌。最新数据表明，大面积烧伤患者血浆中HMGB1水平明显升高。然而，HMGB1在烧伤后KCs释放促炎性细胞因子中的作用目前仍未完全阐明。细胞外HMGB1的生物学功能通过激活连接到TLR2，TLR4，TLR9和晚期糖基化终末产物受体(RAGE）的信号转导途径介导。研究表明RAGE在HMGB1引起的巨噬细胞活化中只起到次要作用，HMGB1主要通过Toll样受体信号途径（特别是TLR2和TLR4）起到引起炎症反应的作用。研究发现烧伤后大鼠巨噬细胞TLR2和TLR4表达增加，TLR4缺陷小鼠烧伤后不易发生肝损伤。二.研究目的基于其在炎症病理生理过程中的关键作用，HMGB1可能参了烧伤后KCs中炎症因子的合成调节。因此，本研究主要有三个目的：①探讨HMGB1对严重烧伤后KCs的功能影响；②研究严重烧伤后HMGB1对KCs作用的受体机制。是否存在几种受体的共存？RAGE受体和TLR受体谁起主要作用？③探讨严重烧伤后HMGB1对KCs作用的受体后信号转导机制。“MAPK和NF-κB信号通路”关键分子是否参与HMGB1调控烧伤后KCs的活化？三.研究内容第一部分高迁移率族蛋白B1对严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子的影响实验使用健康成年雄性SD大鼠32只，体重200-250g，购自安徽医科大学动物中心。大鼠实验前进行一周环境适应。大鼠分为A组（烫伤组）及B组（假烫组），A组大鼠(16只)予戊巴比妥（30mg/kg）腹腔内注射麻醉，剃除背部毛发，大鼠背部置于98℃的热水中浸润12秒，获得总体表面积（TBSA）30%的Ⅲ°烫伤模型（经病理切片证实，以下称烧伤）。烧伤后立即给予每只大鼠腹腔注射乳酸林格氏液（30ml/kg）复苏；假烫组（16只）大鼠予同样的处理，但给予室温水水浴且不予液体复苏。各组大鼠于烧伤或假烫后24h行心脏取血处死。采用肝脏原位灌注、密度梯度离心和选择性粘附法分离KCs。分别经锥虫蓝染色和乳胶微粒吞噬实验判断和鉴定。KCs活性和纯度均大于95%以上。分离后的KCs以1×10~6每孔的密度接种于24孔板中。A、B两组大鼠KCs各分为4组，分别接受不同浓度HMGB1（0、50、100、200ng/mL）刺激48h。收集细胞培养的上清液，使用大鼠TNF-α和IL-1β酶联免疫吸附试剂盒（美国BioSource公司）检测，相关操作按照生产商提供的说明书实行。第二部分RAGE受体在高迁移率族蛋白B1诱导严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子中的作用健康成年雄性清洁级SD大鼠32只，体质量200~250g，购自安徽医科大学实验动物中心。大鼠常温下饲养1周，20g/L戊巴比妥钠腹腔注射（30mg/kg）麻醉后，背部置于98°C水中12s，造成30%TBSA Ⅲ度烫伤（经病理切片证实，以下称烧伤），烧伤后立即给予乳酸林格液腹腔注射（30mL/kg）进行液体复苏。伤后24h行心脏取血处死大鼠，采用肝脏原位灌注、不连续密度梯度离心和选择性粘附法分离KCs。分别经锥虫蓝染色和乳胶微粒吞噬实验判断和鉴定。KCs活性和纯度均大于95%以上。（1）取部分细胞按随机数字表法分为2组，各组样本数为8：①PBS对照组，加入1mL PBS液培养；②HMGB1刺激组，加入1mL浓度为100ng/mL HMGB1刺激。培养48h后行RAGE检测。（2）另取部分细胞按随机数字表法分为4组，各组样本数为8：①对照组，加入1mL PBS液培养；②HMGB1组，加入1mL浓度为100ng/mL HMGB1培养；③HMGB1＋抗RAGE抗体组，经1mL浓度为20μg/mL抗大鼠RAGE单克隆抗体孵育2h后，加入1mL浓度为100ng/mL HMGB1刺激；④HMGB1＋重组大鼠RAGE/Fc嵌合体（rrRAGE/Fc）组，0.5mL浓度为100ng/mL HMGB1与0.5mL浓度为5μg/mLrrRAGE/Fc孵育2h后，作用于细胞。培养48h后行TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA表达检测。第三部分Toll样受体在高迁移率族蛋白B1诱导严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子中的作用健康成年雄性清洁级SD大鼠32只，体质量200~250g，购自安徽医科大学实验动物中心。大鼠常温下饲养1周，20g/L戊巴比妥钠腹腔注射（30mg/kg）麻醉后，背部置于98°C水中12s，造成30%TBSA Ⅲ度烫伤（经病理切片证实，以下称烧伤），烧伤后立即给予乳酸林格液腹腔注射（30mL/kg）进行液体复苏。伤后24h行心脏取血处死大鼠，采用肝脏原位灌注、不连续密度梯度离心和选择性粘附法分离KCs。分别经锥虫蓝染色和乳胶微粒吞噬实验判断和鉴定。KCs活性和纯度均大于95%以上。分离后的KCs以每孔1×106个的密度接种于24孔板中。大鼠的KCs分离后分为四组：⑴对照组，RPMI-1640培养液中培养48h；⑵HMGB1刺激组，100ng/ml HMGB1刺激48h；⑶HMGB1+抗TLR2抗体组，20μg/ml抗TLR2抗体（美国Invivgen公司）培养2h后加入100ng/ml HMGB1刺激48h；⑷HMGB1+抗TLR4组,20μg/ml抗TLR4抗体（美国Invivgen公司）培养2h后加入100ng/ml HMGB1刺激48h。ELISA法测定KCs上清液中的TNF-α和IL-1β含量。Northern blot法检测KCs中TNF-α和IL-1β mRNA的表达，Westernblot法检测KCs中p38及JNK的表达，EMSA法检测KCs中NF–κB活性。四．研究结果第一部分来源于对照组和烧伤组大鼠的KCs分别用不同浓度的HMGB1（50-200ng/ml）处理48小时。运用ELISA法检测上清液中的TNF-α和IL-1β蛋白含量。结果表明：在正常情况下，KCs仅产生极少基础量的TNF-α和IL-1β。HMGB1通过剂量依赖的方式刺激KCs分泌TNF-α和IL-1β。此外，在至少给予50ng/ml剂量的HMGB1刺激情况下，烧伤组大鼠KCs产生TNF-α和IL-1β显著多于对照组。这种差异在使用100ng/ml或者更高浓度HMGB1刺激的实验组中更为明显。第二部分培养48h后，HMGB1刺激组KCs表面RAGE表达水平（1.036±0.101）明显高于PBS对照组(0.191±0.024，t=-23.158，P=0.000)。培养48h后，与对照组比较，HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组和HMGB1+rrRAGE/Fc组KCs培养上清液中TNF-α和IL-1β含量均显著增高（P值均小于0.01），后3组组间两两比较差异均无统计学意义（P值均大于0.05）。培养48h后，与对照组比较，HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组和HMGB1+rrRAGE/Fc组TNF-α、IL-1β mRNA表达水平均显著增高（P值均小于0.01），后3组组间两两比较差异均无统计学意义（P值均大于0.05）。第三部分使用抗TLR2抗体或抗TLR4抗体预培养KCs都显著减少了HMGB1诱导的TNF-α和IL-1β分泌（p<0.01）。抗TLR4抗体较之抗TLR2抗体对HMGB1诱导的TNF-α产生具有更强的抑制作用（73%对53%，p<0.05），HMGB1+抗TLR4抗体组KCs细胞培养上清液中TNF-α水平与阴性对照组相似（p>0.05）。同时，TLR2阻断较之TLR4阻断更显著的抑制HMGB1诱导的IL-1β产生（80%对50%，p<0.05），在HMGB1+抗TLR2组，KCs培养液上清液中的IL-1β水平与无HMGB1刺激的细胞相似（p>0.05）。同时，KCs RNA的Northern blot分析表明：使用HMGB1刺激48小时后的KCs TNF-α和IL-1β的mRNA水平显著增加。此外，经过抗TLR2和TLR4预培养的烧伤后大鼠KCs显著抑制了HMGB1诱导的TNF-α和IL-1β的mRNAs表达(p<0.01)。与对照组相比，给予HMGB1刺激的KCs中，p38的磷酸化明显增加。抗TLR2和抗TLR4抗体均显著减少HMGB1刺激引起的p38的磷酸化，分别减少了75％和71％。总p38的表达各组之间没有显著差异。此外，与未接受HMGB1刺激的KCs相比，HMGB1刺激可以显著上调KCs中JNK的活性。给予烧伤后大鼠KCs抗TLR2和抗TLR4抗体预培养，可以对JNK的活化起到类似予抑制p38活化的抑制作用。随着时间的推移，总JNK的表达没有改变。本实验中，使用EMSA法检测烧伤大鼠KCs中反射性标记的NF-κB结合序列的核蛋白质结合活性。与对照组相比，100ng/ml HMGB1刺激48h后，NF-κB的活化显著增加（p<0.01）。这种上调作用可以被抗TLR2或抗TLR4预处理大大减弱(p<0.01)。五．研究结论1. HMGB1以剂量依赖性的方式刺激KCs分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-1β。烧伤大鼠的KCs对于HMGB1刺激引起的TNF-α和IL-1β表达比未烫伤大鼠更敏感。2. HMGB1引起烧伤KCs促炎性细胞因子的产生和释放并不主要依赖RAGE。3. HMGB1诱导烧伤后KCs促炎细胞因子的产生主要是通过Toll样受体依赖的MAPK/NF-κB信号通路介导。TLR4在HMGB1诱导KCs表达TNF-α的过程中起到更重要的作用，而HMGB1诱导KCs表达IL-1β主要依靠TLR2介导。TLR2和TLR4在烧伤后KCs中HMGB1信号转导引起的细胞因子释放过程中发挥着不同作用。