【目的】在牙周炎的发病过程中,牙周致病菌作用于宿主防御系统,激活免疫细胞,引起炎症介质和细胞因子的分泌,从而可导致牙周炎症微环境的变化。免疫代谢组学是一新提出的概念,指免疫细胞在受到病原微生物刺激后,由静息状态被激活的过程中,其代谢方式会发生从氧化磷酸化途径向糖酵解途径的转变,即发生代谢重组,为免疫细胞的激活提供能量和合成底物。PKM2是糖酵解途径的关键酶之一,研究报道其在炎症过程中表达增高,提示其可能参与炎症反应的进程。目前,在牙周炎领域关于代谢重组和PKM2作用的报道尚少。本研究旨在探讨:1)牙周炎组织中是否发生了代谢重组;2)PKM2在P.gingivalis刺激牙周组织引起的炎症反应过程中发挥了何种作用;3)能否通过调控PKM2的表达以调节牙周炎症微环境内细胞的代谢重组,从而对炎症的发生发展起调控作用。【方法】1.收集健康及慢性牙周炎的牙龈组织。排除标准包括系统疾病史、吸烟史、免疫病史和妊娠或哺乳期妇女。健康组纳入行牙冠延长术、智齿拔除或埋伏阻生牙开窗术需切龈的患者,要求其临床表现无明显牙龈炎症:无牙龈红肿,无探诊出血,取材位点牙周袋探诊深度<3 mm且无附着丧失;慢性牙周炎组纳入半年内未行牙周治疗,患牙Ⅲ度松动的重度牙周炎患者,且患者半年内未服用任何影响牙周状态的药物如免疫抑制剂、性激素和抗生素等。患者均知情同意。通过q PCR和免疫组化方法分析两种临床牙周组织中氧化磷酸化途径和糖酵解途径关键酶的表达以及炎症细胞因子表达的差异;2.体外培养HGFs、THP-1和P.gingivalis。首先,向HGFs和THP-1给予P.gingivalis刺激,使用LDH试剂盒和CCK-8测定不同感染复数(MOI)的P.gingivalis的细胞毒性,使用q PCR和WB测量HGFs和THP-1中PKM1、PKM2和炎症细胞因子(IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α)的表达情况,以选择合适的MOI进行感染;然后,通过WB测定PKM2随P.gingivalis感染时间延长的变化情况,通过q PCR分析P.gingivalis刺激后HGFs和THP-1代谢重组的发生与否;随后,采用PKM2抑制剂(Shikonin和Compound 3k)及si RNA调控PKM2的表达,通过LDH试剂盒和CCK-8测量不同浓度(0.2、1和5μM)的PKM2抑制剂和si PKM2(20、50和100 n M)的细胞毒性,通过q PCR和WB测定PKM1、PKM2和炎症细胞因子(IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α)的表达情况,以选择合适的浓度;最后,向HGFs和THP-1给予P.gingivalis刺激和PKM2抑制或si PKM2阻断,通过q PCR和WB测定PKM1、PKM2和炎症细胞因子表达的变化情况。【结果】1.不同类型的临床牙周组织中氧化磷酸化途径和糖酵解途径的关键酶,以及炎症细胞因子的表达存在差异。q PCR分析示,在炎症牙龈组织中,糖酵解途径关键酶(PKM1、PKM2、HK2、PFKFB3、LDHD、Acetyl-Co A)和氧化磷酸化途径关键酶(IDH1、IDH2、OGDH、SDHA、SDHB)的表达上调(P<0.05),而氧化磷酸化途径关键酶FH的表达下调(P<0.05);免疫组化结果示,炎症牙龈组织中PKM1和PKM2的表达高于正常牙龈组织;2.P.gingivalis感染后,HGFs和THP-1的死亡率随MOI的增大和感染时间的延长而升高,且两种细胞对P.gingivalis刺激的敏感性不一,HGFs更耐受细菌刺激;P.gingivalis感染后,q PCR和WB示,HGFs和THP-1中PKM2的表达显著升高(P<0.05);与正常细胞相比,q PCR示:HGFs在MOI=250,THP-1在MOI=50时,其PKM2、PKM1与PKM2的比值和炎症细胞因子(IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α)的表达显著升高(P<0.05);3.使用PKM2抑制剂和si PKM2可有效减少正常HGFs和THP-1中PKM2的表达(P<0.05);将PKM2抑制剂和si PKM2作用于被P.gingivalis感染的HGFs和THP-1后,其PKM2、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α的表达与对照组未加药物处理的P.gingivalis感染的细胞相比显著降低(P<0.05)。【结论】1.在临床炎症牙龈组织样本中,发生了代谢改变,在体外P.gingivalis刺激HGFs和THP-1引起的炎症反应中,发生了代谢重组;2.PKM2参与了慢性牙周炎和体外P.gingivalis刺激HGFs和THP-1引起的炎症反应的发生,当炎症发生时,PKM2的表达量显著上升;3.通过抑制PKM2的表达,可以对体外P.gingivalis刺激HGFs和THP-1引起的炎症反应的发生发展进行调控。