研究背景：肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)和乙型肝炎在我国有很高的发病率和死亡率,广西是这两种疾病的高发区。目前对肝癌的诊断手段主要有临床检查、影像、病理检查,但由于肝癌早期临床症状体征不明显,一旦发现多为晚期。因此,寻找肝癌早期血清检测标记物并进行简单有效的检测是本课题研究的重点内容。目前检测HCC的血清标记物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein, AFP),但是其灵敏度并不能让人满意。目前有大量报道称几种指标的联合检测对疾病的检出率有明显提高。本课题组前期研究发现,抗衰老标记蛋白-30 (senescence marker protein-30, SMP30)抗体和抗中性调宁蛋白(H2-calponin, CNN2)抗体主要见于HCC病人,但是对HCC患者血清中SMP30、CNN2蛋白水平的检测目前没有报道。同时已有大量报道称高尔基体糖蛋白(Golgi protein-73, GP73)对肝癌的检出率比较高且与AFP有很好的互补性。研究目的：探讨血清SMP30、CNN2、GP73蛋白含量对HCC的诊断价值及分析三种蛋白和AFP联合检测对HCC诊断的临床意义,为HCC诊断提供更好的选择。研究方法：利用本课题组构建并保存于-80℃的基因工程菌BL21-pET30a-SMP30、BL21-pCold Ⅲ-CNN2表达纯化得到高纯度的SMP30蛋白和CNN2蛋白,并以此作为标准蛋白,分别建立双抗体夹心ELISA,同时购买Gp73检测试剂盒，检测原发性肝癌患者、慢性乙肝患者、慢性乙肝携带者、肝硬化患者及正常人血清中SMP30、CNN2、GP73蛋白含量。研究结果：1.表达纯化的SMP30浓度为0.6mg/mL,纯度为92.82%,双抗体夹心ELISA包被抗体(兔抗人SMP30多克隆抗体)、检测抗体一抗(鼠抗人SMP30单克隆抗体)以及酶标二抗(羊抗鼠1g G-HRP)的最佳工作稀释比例分别为1：200,1：400,1：5000,血清最佳稀释比例为1：5,标准曲线的回归方程为：y=1.673x+0.025,R2=0.996,P<0.001,标准蛋白在3.6～500ng/mL之间有很好的的剂量效应关系。批内和指间变异系数分别为8%和12%。HCC组、肝炎组、健康组的阳性率分别为8.4%(21/250)、0.6%(1/170)、1.4%(3/217),HCC阳性率高于肝炎组(P<0.001)和健康组(P=0.001),尚不能认为肝炎组和健康组的阳性率有差别(P=0.795)HCC组血清标本SMP30蛋白含量明显高于正常对照组(P=0.002)和肝炎组(P=0.001),正常对照组与肝炎组差异无统计学意义(P=0.503)。该方法的敏感度为8.4%,特异度为98.86%。血清中SMP30蛋白含量与HCC患者的年龄、AFP含量、肝功能、肿瘤大小、临床分期、肿瘤病理等临床指标无显著性相关。2.双抗体夹心ELISA包被抗体(羊抗人CNN2多克隆抗体)、检测抗体一抗(兔抗人CNN2多克隆抗体)以及酶标二抗(羊抗兔1g G-HRP)的最佳工作稀释比例分别为1：200,1：2000,1：5000,血清最佳稀释比例为1：10。检测结果,HCC组、健康组和肝炎组的阳性率分别为2.1%(3/143)、2.8%(6/217)和2.4%(4/170)。三组的CNN2蛋白含量差异无统计学意义。该方法的敏感度为2.4%,特异度为97.2%。血清中CNN2蛋白含量与临床指标之间尚不能确定有关。3.血清GP73蛋白水平在HCC、肝硬化、慢性乙肝、慢性乙肝携带者、健康人分别为88.09±64.13、184.20±88.70、149.53±89.76、39.32±8.99和25.27±12.221(ng/mL)。健康组中,血清GP73蛋白水平在不同性别中没有差别(P=0.819)；HCC组中,男患者血清GP73蛋白水平高于女患者(P=0.001),有肝硬化的患者高于无肝硬化的患者(P=0.002),肿瘤直径>3cm的患者高于肿瘤直径<3cm的患者(P=0.020)。GP73诊断HCC的临界值为61.93ng/mL,特异度为98.56%,灵敏度为56.93%。4.多个HCC相关抗原同时检测可以显著提高HCC的检出率。联合检测价值最高的组合为AFP+GP73,阳性率为82.35%。结论：1.成功建立了双抗体夹心ELISA检测人血清SMP30蛋白,所建立的ELISA方法,批内批间差异和稳定性均满足实验要求。HCC血清SMP30检出率大于健康组和肝炎组,提示SMP30有望成为一种新的肝癌血清标志物。2.HCC血清CNN2水平与健康组和肝炎组没有差别,尚不能用作肝癌血清标志物。3.GP73是一种敏感度和特异度都很好的肝癌血清标志物,可以和AFP媲美。4.联合检测可以有效减少AFP阴性的肝癌的漏诊率,提高肝癌的检出率。