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第一部分:HIF-1α在卵巢癌组织中表达及其诱导卵巢癌紫杉醇耐药作用研究目的:探讨HIF-1α在上皮性卵巢癌组织中的表达,并在体外实验中进一步探讨在缺氧条件下HIF-1α诱导卵巢癌细胞株紫杉醇化疗耐药作用,为进一步机制研究提供基础。方法:选取原发性上皮性卵巢癌病例及卵巢癌SKOV3细胞株作为研究对象。1、分别针对正常卵巢、上皮性卵巢癌组织和缺氧条件下的卵巢癌SKOV3细胞采用免疫组化和免疫印迹检测HIF-1α表达;2、在构建物理性诱导的SKOV3细胞缺氧模型中,用0、4、8、12μmol/L的紫杉醇处理,采用CCK-8检测细胞抑制率,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果:1、与正常卵巢组织相比,在原发性上皮性卵巢癌病理组织标本中HIF-1α呈高表达,差异具有统计学意义（P＜0.001）。2、在缺氧条件下,免疫印迹和免疫组化结果都发现:与常氧状态相比,缺氧条件下SKOV3细胞中HIF-1α蛋白表达水平增加,24小时后达到高峰,48小时后略有下降,差异具有统计学意义（P＜0.001）;3、随着紫杉醇浓度的增加,与常氧组相比,缺氧组SKOV3细胞抑制率和凋亡率都同时下降,对紫杉醇敏感性下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论:HIF-1α在原发性卵巢癌组织及缺氧环境下的卵巢癌SKOV3细胞株中都呈高表达状态。缺氧诱导HIF-1α表达上调使细胞增殖能力增加,凋亡率下降,诱导卵巢癌细胞紫杉醇耐药。第二部分:HIF-1α上调miR-27a表达并诱导卵巢癌紫杉醇耐药的机制研究目的:探讨HIF-1α靶向调控miR-27a的机制以及miR-27a对缺氧诱导卵巢癌紫杉醇耐药的影响。方法:1、通过生物信息学分析和RT-PCR验证miR-27a在卵巢癌组织中表达水平及其与HIF-1α蛋白水平表达的相关性分析;2、运用RT-PCR检测与常氧相比,缺氧环境下miR-27a在SKOV3细胞表达情况;3、利用RNA干扰技术沉默HIF-1α表达后,免疫印迹检测HIF-1α蛋白表达水平变化,RT-PCR检测miR-27a表达变化;4、在常氧和缺氧条件下,过表达或者抑制miR-27a后紫杉醇处理SKOV3细胞检测增殖、凋亡的变化;5、通过CHIP-qPCR和双荧光素酶报告基因检测HIF-1α与miR-27a启动子结合情况。结果:1、生信分析发现HIF-1α与miR-27a存在相关性,并且HIF-1α可能与miR-27a启动子结合;与正常卵巢组织相比,上皮性卵巢癌组织标本中miR-27a呈高表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）;随着缺氧干预时间的增加,SKOV3细胞miR-27a的miRNA表达水平增强,在24h和48h时分别增高1.6倍和4.1倍,差异具有统计学意义（P＜0.01,P＜0.001）;miR-27amiRNA表达水平变化与HIF-1α蛋白表达水平变化趋势一致;2、HIF-1αshRNA沉默HIF-1α基因表达后,与阴性对照组相比,缺氧组中HIF-1α和miR-27a的表达均显著下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）,且HIF-1α和miR-27a变化趋势是一致的;3、将SKOV3细胞分别转染miR-27a抑制剂及模拟物后,分别给予0、4、8、12μmol/L的紫杉醇,随着紫杉醇浓度增高,与常氧组相比,miR-27a过表达组胞增殖能力增强,差异具有统计学意义（P＜0.01）,对紫杉醇的敏感性降低;而miR-27a抑制剂组细胞增殖能减弱,差异具有统计学意义（P＜0.01）,对紫杉醇的敏感性增强;miR-27a过表达组胞凋亡率下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）,对紫杉醇的敏感性降低;而miR-27a抑制剂组细胞凋亡升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）,对紫杉醇的敏感性增强;4、CHIP-qPCR发现HIF-1α能够在miR-27a启动子区域两个位点发生富集;双荧光素酶报告基因检测发现HIF-1α能够激活miR-27a启动子的转录。结论:miR-27a在卵巢癌组织中高表达,miR-27a过表达后,细胞的增殖能力增加,凋亡率降低,诱导紫杉醇耐药。而抑制其表达后,细胞的增殖能力降低,凋亡率升高,对紫杉醇敏感性升高。因此,在缺氧的环境下,HIF-1α通过上调miR-27a表达,影响卵巢癌细胞的增殖及凋亡,参与肿瘤细胞耐药的过程,而且HIF-1α上调miR-27a表达可能是通过HIF-1α结合在miR-27a启动子区发生转录激活效应。第三部分:miR-27a靶向APAF-1诱导卵巢癌紫杉醇耐药的机制研究目的:探讨卵巢癌紫杉醇耐药过程中miR-27a对APAF-1靶向调控作用,分析两者在缺氧诱导卵巢癌紫杉醇化疗耐药中的调控关系。方法:1、miR-27a靶基因预测以及APAF-1的挑选和结合位点验证;2、双荧光素酶报告基因检测系统检测野生型及突变型结合反应活性;3、免疫印迹检测卵巢癌组织及正常卵巢组织、SKOV3细胞在缺氧条件下APAF-1蛋白表达水平;4、免疫印迹检测SKOV3细胞分别过表达或抑制miR-27a条件下,常氧或缺氧处理后APAF-1 蛋白表达水平;5、SKOV-3 细胞分别转染 miR-27a OE、APAF-1 OE,miR-27a OE+APAF-1 OE质粒,缺氧状态下予以紫杉醇处理后,检测各组细胞增殖和凋亡率的变化。6、构建 SKOV3 细胞的 miR-27a OE、APAF-1 OE、miR-27aOE+APAF-1 OE稳转细胞株,建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后予以紫杉醇皮下注射每3天/次,剂量为5mg/kg,记录生长曲线,停药1周后处死裸鼠,剥离肿瘤组织,记录肿瘤体积,并对切除的肿瘤组织分别检测APAF-1蛋白表达水平。结果:1、采用多个靶基因预测软件综合数据分析发现APAF-1 mRNA3’非编码区预测到两个miR-27a结合位点,二者具有一定的关联性;2、与突变型对照质粒相比,野生型表达载体报告基因活性显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）,证实APAF-1是miR-27a的靶基因;3、与正常卵巢组织相比,上皮性卵巢癌组织中APAF-1呈低表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。随着SKOV3细胞缺氧处理时间的延长,细胞内APAF-1蛋白表达水平逐渐降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）,可见在缺氧环境下APAF-1蛋白呈低表达;4、miR-27a OE转染组中APAF-1蛋白表达水平较其它各组显著下调,而抑制miR-27a表达可使内源性APAF-1蛋白表达量显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;APAF-1 OE组APAF-1蛋白表达水平较其它各组显著上调,差异具有统计学意义（P＜0.001）;5、与对照组相比,miR-27a OE组细胞在给予紫杉醇处理过程中,随着紫杉醇浓度的增加,细胞的增殖能力显著增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而APAF-1 OE组细胞的增殖能力降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）,在miR-27a及APAF-1均过表达后,SKOV3细胞的增殖能力出现下降趋势,但与对照组相比,差异不具有统计学意义（P＞0.05）;6、与对照组相比,miR-27a OE组细胞予以紫杉醇处理后凋亡率降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;而APAF-1 OE组细胞的凋亡率显著上升,差异具有统计学意义（P＜0.001）;同时转染miR-27a OE和APAF-1 OE质粒组细胞的凋亡率出现一定程度上升,与对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。7、体内裸鼠模型中,miR-27a OE组裸鼠的肿瘤体积最大,皮下移植瘤生长速度逐渐高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.001）,APAF-1 OE组的裸鼠肿瘤体积最小,皮下移植瘤生长速度逐渐低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.001）;荷瘤裸鼠肿瘤的APAF-1蛋白表达水平:APAF-1 OE组及miR-27a OE+APAF-1 OE组的APAF-1表达水平显著升高,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.001）;miR-27a OE组APAF-1表达水平较低,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:在卵巢癌组织及缺氧条件下SKOV3细胞中APAF-1蛋白呈低表达,与miR-27a表达体现出相反的趋势,表现出抑癌作用。体外及体内实验均证实miR-27a负向靶控APAF-1影响卵巢癌细胞的增殖及凋亡。miR-27a过表达可以抑制APAF-1表达,在紫杉醇处理过程中,卵巢癌细胞增殖能力及抗凋亡性明显增加,肿瘤增长速度加快,对紫杉醇敏感性下降,耐药性增加;miR-27a表达受到抑制后促进APAF-1表达,在紫杉醇处理过程中,卵巢癌细胞增殖能力降低,凋亡率增加,肿瘤增长速度减慢,对紫杉醇敏感性增加,耐药性降低。第四部分:miR-27a靶向抑制APAF-1保护卵巢癌免受紫杉醇诱导的细胞凋亡的途径目的:探讨在缺氧环境下,miR-27a靶向APAF-1诱导卵巢癌细胞株紫杉醇化疗过程中细胞凋亡的主要途径,进一步分析miR-27a保护卵巢癌细胞免受紫杉醇诱导的细胞凋亡的机制。方法:在常氧或者缺氧条件下,通过miR-27a过表达或抑制,检测APAF-1、细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平;线粒体膜电位、ATP合成能力以及ROS活性氧的表达。结果:1、免疫印迹检测发现miR-27a在卵巢癌细胞内表达增加,APAF-1、细胞色素C、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）;Caspase-8蛋白表达水平变化不显著,差异不具有统计学意义（P＞0.05）;2、当miR-27a过表达后,肿瘤细胞质内的应力纤维明显增加,并且呈板状伪足进行聚合,其线粒体绕细胞核周的分布性明显加强,数量明显增多,提示miR-27a过表达后肿瘤细胞内线粒体活性升高;3、miR-27a过表达后线粒体呈现出高能量状态,其ATP合成能力明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）;而抑制miR-27a表达后线粒体呈现出低能量状态,ATP合成能力明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.01;4、随着miR-27a在卵巢癌细胞内表达含量增加,其ROS活性氧水平明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论:在缺氧环境下,miR-27a靶向APAF-1调控卵巢癌细胞凋亡进程主要通过线粒体途径进行,与受体死亡途径关联性较小。当miR-27a在卵巢癌细胞内过表达时,APAF-1表达受到抑制,Caspase家族Caspase-3及Caspase-9激酶表达降低,促进线粒体的微丝迁移能力、膜电位、ATP合成能力及ROS活性氧表达增加,卵巢癌细胞凋亡能力降低,从而保护卵巢癌细胞免受紫杉醇诱导的细胞凋亡。全文结论:1、在卵巢癌组织中,HIF-1α及miR-27a呈高表达。缺氧通过HIF-1α诱导miR-27a表达上调,促进卵巢癌细胞增殖,抑制细胞凋亡,诱导紫杉醇耐药;2、在卵巢癌中APAF-1是miR-27a调控的的靶基因之一;3、miR-27a通过靶向下调APAF-1促进卵巢癌细胞增殖、抑制细胞凋亡,诱导紫杉醇耐药;4、在缺氧环境下,miR-27a通过抑制APAF-1影响卵巢癌细胞凋亡进程可能通过线粒体途径进行,从而保护卵巢癌细胞免受紫杉醇诱导的细胞凋亡。在缺氧环境下卵巢癌细胞紫杉醇耐药过程具体通过HIF-1α-miR-27a-APAF-1作用轴实现。