PreS1感染决定区随机化HBV库的构建及其感染常用小动物的初步研究

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乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒,对宿主的特异性要求非常严格,只能感染与其天然宿主种属关系接近的动物。目前用于研究HBV感染的动物模型主要有黑猩猩、树鼩、土拔鼠、鸭及各种小鼠模型,但由于来源困难、价格昂贵、感染效率低、结果稳定性差、繁殖率低、凶猛难操作、模型制备困难,不能完全重复HBV的整个感染周期等各种原因,限制了它们的应用。为了弥补上述缺陷,构建新型乙型肝炎动物模型当前研究HBV的热点及难点。多年的研究证实,HBV的PreS1区参与病毒感染早期的结合及进入,决定了宿主的种族及组织特异性。其中有试验指出其主要活性部位最小可限制在aa5-20序列。基于此原理,本课题采用基因重组技术分别对HBVPreS1区的aa9-17、aa12-21、aa16-24序列进行随机化改造,构建PreS1感染决定区随机的复制型HBV载体库,并对其感染常用小动物进行初步研究。本课题由两部分构成。第一部分PreS1感染决定区随机化HBV库的构建目的:对HBV PreS1区的aa9-17、aa12-21和aa16-24序列分别进行随机化改造,构建PreS1感染决定区随机化HBV库。方法:1应用基因重组技术,以pCH-3093为载体,依次构建3种过渡质粒pCH-3093-Alw(-)、pCH-3093-AlwNl、pCH-3093-Insert。2设计并合成PreS1区的3种随机引物S1rand9-17、S1rand12-21、S1rand16-24及一种3’端与随机引物互补的引物S11038(-)。三种随机引物分别与S11038(-)引物在Klenow Fragment作用下延伸为双链,即可合成随机片段。3通过一系列质粒构建,将随机片段插入到野生型HBV相应的PreS1区,即可构成PreS1感染决定区随机化HBV库。4检测PreS1感染决定区随机化HBV库的库容、随机性及复制能力。结果:1本研究成功构建了3种过渡质粒pCH-3093-Alw(-)、pCH-3093-AlwNl、pCH-3093-Insert,并进行了大小及酶切位点鉴定。2合成了PreS1区的3种随机引物S1rand9-17、S1rand12-21、S1rand16-24及1种与随机引物的3’端互补的引物S11038(-)。并成功合成了3种随机片段,将3种随机片段插入到野生型HBV PreS1的相应区域,构建了PreS1感染决定区随机化HBV库。4通过统计分析证实,三种随机库库容约为107,氨基酸的实际分布与理论频数无显著性差异,并扩增获得大量高纯度的随即库质粒。SouthernBlotting检测证实,三种随机库的复制能力接近,比野生型HBV弱。结论:本研究成功构建了3种PreS1感染决定区随机化HBV库pCH-S1-917、pCH-S1-1221、pCH-S1-1624,随机库具有较大的库容及良好的随机性。3种随即库的复制能力接近,但比野生型HBV弱。考虑随即库种的某些碱基影响了病毒的复制能力,但并不影响随即库的应用。这3种随机库为探索相应HBV动物模型提供了一种便利的试验工具。第二部分应用PreS1感染决定区随机化HBV库感染常用小动物目的:利用PreS1感染决定区随机化HBV库感染Wistar大鼠、SD大鼠、BALB/C小鼠、和新西兰小白兔,了解病毒库的感染能力。方法:1分别给Wistar大鼠、SD大鼠、BALB/C小鼠和新西兰小白兔注射3种PreS1感染决定区随机性HBV库pCH-S1-917、 pCH-S1-1221、pCH-S1-1624,并于1个月和2个月后分别化验血清HBV-DNA定量。2注射病毒后2个月时,处死动物并分别提取肝组织内的HBV cccDNA。以所提取的HBV cccDNA为模板,扩增HBV PreS1区的随机序列,将随机序列插入到野生型HBV的相应部位,构建二代PreS1感染决定区随机化HBV库,并进行测序。3应用二代随机库再次注射相应动物,并于1个月和2个月时分别化验血清HBV-DNA定量。42个月时取感染动物的肝组织行免疫组织化学检查,了解HBsAg和HBcAg的表达情况。结果:1注射病毒后动物的一般情况良好,较注射前无明显变化,1个月时化验血清HBV-DNA定量。化验结果显示所有注射随机病毒的动物均阳性,W7的病毒滴度量最高,为2.43×105copies/mL;其余定量介于103-104copies/mL之间。注射野生型的对照动物均阴性。2新西兰小白兔和BALB/C的肝组织中可扩增出相应的HBV PreS1感染决定区的随机片段,而Wistar大鼠、SD大鼠阴性对照动物扩增结果均为阴性,可能在注射病毒2个月后Wistar大鼠和SD大鼠大鼠体内的病毒已清除。3将从兔子和BALB/C小鼠肝组织内所扩增出的随机片段插入到野生型HBV的相应序列内,成功构建了二代PreS1感染决定区随机化HBV库pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse。4对随机库pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse进行测序,结果显示前者21个菌落均来自随机库pCH-S1-1221;后者除1个来自pCH-S1-917,其余的15个来自随机库pCH-S1-1221。5二代随机库pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse分别感染兔子及BALB/C小鼠,于第1个月和第2个月时化验血清HBV-DNA,结果显示前后两个月的病毒定量无明显变化,均为弱阳性。6第一和第二代病毒库所感染动物的肝组织均有HBsAg和HBcAg的表达。以Wistar大鼠表达量最高,肝细胞内外均可检测到。结论:应用PreS1感染决定区随机化HBV库成功感染了Wistar大鼠、Sprague Dawley大鼠、新西兰小白兔和BALB/C小鼠。并可在血清内检测出HBV-DNA,于肝组织内检测出HBsAg和HBcAg两种抗原的表达。于肝组织内扩增出感染的HBV基因组并测序,结果证实HBV PreS1区aa12-21序列在HBV感染过程中具有重要作用,并在一定程度上影响着HBV的宿主特异性。但随机库所引起的感染也为急性过程,需进行进一步改造,试图在基因水平上抑制宿主的免疫反应,从而达到慢性感染,为研究HBV提供一种更为理想的感染动物模型。
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