细胞色素P450酶(CYP)是一大类含有血红素分子的单加氧酶超家族,因其还原态与一氧化碳(CO)作用后,形成的复合物在450nm波长处会产生特异吸收峰而得名。在人体内,P450酶可以催化多种内源性物质(如性激素、糖皮质激素、胆固等)和外源性物质(如药物、毒物、前致癌物等)的I相代谢反应,包括羟基化,N-,O-和S-脱烷基化,磺化氧化,环氧化,脱氨,脱卤,过氧化和N-氧化还原,将亲脂性化合物转化为更亲水的代谢物。在人体中,已经发现了57种功能性P450酶。其中,大多数的人类P450酶,例如CYP1A2,CYP2B6,CYP2A6,CYP2C8,CYP2C9,CYP19,CYP2E1,CYP2D6和CYP3A4主要位于肝脏,并因其在药物代谢中的重要性已被进行广泛而深入的研究。然而,P450酶在肝脏以外人体器官中的研究则十分有限。细胞色素P450还原酶(CPR或POR)是微粒体中P450酶的主要电子供体。有研究表明,在POR敲除的小鼠模型中,骨骼中POR的缺失会导致颅骨发育缺陷和长骨中小梁骨密度降低。这表明了POR/CYP系统在骨骼的生长和发育中有着非常重要的意义。许多P450酶的代谢物都对骨骼的发育至关重要,包括视黄酸,胆固醇,维生素D和雌激素。有研究表明,几种人类P450酶,CYP11A1,CYP17A1,CYP19A1,CYP24A1和CYP27B1,都在成骨细胞中有表达。在小鼠中,Cyp11a1,Cyp39a1,Cyp51也曾被证实在参与类固醇代谢的骨祖细胞中有表达。而人类CYP17A1以及小鼠Cyp1,Cyp27b1和Cyp11a1等基因的功能丧失性突变所造成的影响也表明这些基因确实参与了骨骼的生长与发育。然而,人骨细胞中不同CYPs的表达水平及其在骨生物学中所起的作用至今尚不明确。目前,有多种细胞培养模型可用于研究成骨细胞生物学,包括来自不同物种的原代细胞,由多能干细胞诱导而来的成骨细胞,永生化和恶性细胞系;所有这些以及其它体外细胞模型都有其特定的优点和缺点。为了深入了解P450酶在人类成骨细胞中所起的作用,并对体外研究系统进行评估,此项研究的目标之一是探究四种不同人类成骨细胞模型中几种P450酶的表达水平:包括从人骨碎片中培养出的成骨细胞,从人骨膜间充质干细胞(HPDC)分化而来的成骨细胞,原代人成骨细胞(HOB)和人成骨细胞细胞系MG63。为进行此项研究,我们共选择了8种P450酶,它们都涉及了一系列不同的生理过程:包括两种催化类固醇生物合成关键步骤的P450酶(CYP11A1和CYP17A1),一种参与胆固醇生物合成的酶(CYP51A1),一种参与胆固醇降解的酶(CYP39A1),两种参与维生素D代谢的酶(CYP24A1和CYP27B1),一种参与维生素A代谢的酶(CYP26A1),最后是CYP2E1,除其他特性外,最值得注意的是它可以大量生产活性氧(ROS),而活性氧的存在可以将P450酶的活性与骨骼中的信号传导和衰老进程联系起来。骨是一种活体器官,主要由骨组织(骨细胞、胶原纤维和基质)构成,具有一定形态和构造,外被骨膜,内容骨髓,含有丰富的血管、淋巴管及神经,不断进行新陈代谢和生长发育,并有修复、再生和改建的能力。骨骼中的细胞构成包括成骨细胞,骨细胞,骨衬细胞和破骨细胞,其基质包含有机成分和无机成分。其中,基质会通过羟基磷灰石钙盐的沉积而变得矿化,从而使骨具有强度。骨在身体中起着非常重要的作用,除了保护内脏器官和支持身体结构外,还有一个重要的代谢功能,通过缓冲氢离子浓度的变化来维持血清体内平衡所需的钙和磷酸盐储备。在人的一生中,骨骼会不断进行重塑,以维持破骨细胞和成骨细胞活性之间的动态平衡。负责骨重建过程的骨细胞主要有3种类型,包括成骨细胞(骨形成),破骨细胞(骨吸收)和骨细胞。这3种骨细胞的形成和活性的平衡对骨骼的健康至关重要。骨吸收与骨形成之间的不平衡可导致骨疾病,例如骨质疏松症,这是一种全身代谢性骨病,即以骨量减少和骨组织细微结构破坏为特征而引起骨脆性增大及骨折的疾病,与椎骨和髋部骨折的发病率增加有关,进而导致活动能力丧失甚至死亡。在全球范围内,骨质疏松症被认为是一个严峻的公共健康问题。此外,与健康人群相比,骨质疏松症和脆性骨折在炎症性疾病中更为普遍。例如,慢性炎症性疾病,类风湿性关节炎和炎症性肠病均与骨质疏松症有关。此外,雌激素的水平降低会增加骨和软骨处促炎性细胞因子的分泌,有研究表明,促炎细胞因子是绝经期骨量减少或骨质疏松症的主要介质。然而,炎症改变成骨细胞功能的分子机制至今仍不清楚。全身性炎症会导致血清中促炎性细胞因子如白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-17(IL-17)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平的升高。由于骨骼是血供良好的组织,因此血液循环中那些因全身性炎症而水平升高的炎性细胞因子可以很容易地到达骨细胞,干扰破骨细胞和成骨细胞活性之间的平衡,通常会导致骨质流失。TNF-α可以介导全身性炎症,刺激炎症级联反应的发生。因此,TNF-α在全身性炎症诱导的骨质流失中起着重要的作用。由于许多P450酶的代谢物都与骨发育和骨平衡相关。而且,炎症可以影响人和鼠肝细胞中P450酶的表达水平。因此,骨细胞中表达的P450酶,也许在炎症诱导的骨质流失中起着一定的作用。由于P450酶在骨生物学及炎症诱导的骨质疏松症中所起的作用仍然未知,在这项研究中,我们的目的是研究9种不同CYPs(CYP2E1,CYP11A1,CYP17A1,CYP19A1,CYP24A1,CYP26A1,CYP27B1,CYP39A1和CYP51A1)在MG63和HOB细胞不同分化过程中的表达模式,并探究这些P450酶在这两种成骨细胞中的表达水平是否会受炎症的影响。我们选择TNF-α作为炎性细胞因子来诱导人成骨细胞中的炎症发生。连续7天用TNF-α处理细胞以模拟全身性炎症并分析全身性炎症对成骨细胞中P450酶表达水平的影响。癌症主要是由基因突变引起的,起始于细胞的异常发育,最终导致异常的生长模式,形成良性或恶性的肿瘤。如果癌细胞仍局限于特定的机体器官,那么它被称为良性肿瘤,然而当这些肿瘤细胞开始侵入正常组织周围并通过循环系统或淋巴系统扩散到整个身体时,就会变成恶性肿瘤。癌细胞的转移是恶性肿瘤的特征。大多数癌症患者的死亡是由于癌细胞转移扩散所引起的并发症。因此,转移癌是最严重,也是最危险的癌症。乳腺癌主要是女性的疾病,男性乳腺癌的发生率不到1%。乳腺癌也是女性中最常见的侵袭性癌症,是继肺癌之后女性癌症患者死亡的第二大原因。乳腺癌病变发展过程中最主要的转移部位是骨,肺,局部淋巴结,肝脏和脑,其中最常见的部位是骨。除了BRCA1和BRCA2基因突变之外,诱发乳腺癌的其他主要因素还可能包括肥胖,使用激素疗法(孕激素和雌激素),乳房组织密度增加,酒精的使用和缺乏运动。病变部位局限于乳房和局部淋巴结的乳腺癌仍有被治愈的希望。而那些发生转移,扩散到更远的淋巴结或其他器官,如大脑,骨和肝脏的乳腺癌,以目前现有的治疗方法通常不能治愈。晚期乳腺癌患者中大约有70%都会出现骨转移的状况,这也是患者疼痛的主要原因。骨转移通常会增加患者骨折风险,疼痛,神经压迫和高钙血症的风险,并导致严重的并发症,从而严重威胁人们的日常生活,导致生活质量的下降和医疗保健成本的增加。James Paget于1889年针对肿瘤转移的器官特异性提出肿瘤转移的“种子-土壤”学说,其中骨作为癌细胞(’种子’)定殖和生长的肥沃环境(’土壤’)。根据“种子和土壤”理论,癌细胞很难在其原始地区以外的环境中生存。因此,包括骨在内的任何部位的转移都是非随机过程。特定转移部位的选择性是由肿瘤细胞完成复杂的转移级联步骤的能力和该特定部位支持肿瘤细胞生长的能力所决定的。一旦细胞克服了癌发生的内在障碍,它将需要克服进化完善的用以保护多细胞生物体并维持其稳态的环境障碍。典型的环境障碍包括物理(基底膜),化学(活性氧(ROS),缺氧和低PH)以及生物(免疫监督,抑制性细胞因子和调节性细胞外基质(ECM))成分。骨微环境是独特的,其为癌症的发展提供了肥沃的土壤。据研究表明,骨基质中含有极其丰富的生长因子,其中包括转化生长因子(TGF),胰岛素样生长因子(IGFs),成纤维细胞生长因子(FGFs),血小板衍生生长因子(PDGF)和骨形态发生蛋白(BMPs)。这些生长因子不仅可以促进骨转移癌细胞的生长,还会使肿瘤细胞中细胞因子和其他骨吸收因子的产生和释放增加。而且,这些生长因子会在骨重建过程中释放到骨微环境中。因此,骨基质作为具有丰富生长因子的“肥沃土壤”,可以促进癌细胞“种子”的生长。有研究表明,雌激素在乳腺发育中起关键作用,与乳腺癌风险的增加有关。有一些假说可以用来解释雌激素相关的致癌机制。雌二醇和其他雌激素可以增加乳腺上皮和基质的增殖,从而使快速增殖的上皮增加突变的机会。这些效应会随着雌激素累积暴露的增加而逐渐累积。此外,雌激素可以刺激催乳素的分泌和局部生长促进因子的产生,进而促进癌症的发生。由于雄激素可直接被芳香化酶转化为雌酮和雌二醇,因此,乳腺癌风险的增加也与高于正常水平的雄烯二酮和罩酮有关。通过雄激素经芳香化反应后获得的雌激素是乳腺组织中最重要的雌激素来源。鉴于由CYP19A1基因编码的芳香化酶是催化雄激素向雌激素转化的限速酶,阻断芳香化酶活性己成为一种重要的药理学工具,用以治疗雌激素依赖性疾病如乳腺癌,子宫内膜异位症和子宫内膜癌。众所周知,CYP11A可以催化胆固醇形成孕烯醇酮,CYP17可以催化孕烯醇酮形成雄激素。此外,有研究表明CYP4Z1在乳腺癌中会过度表达,并促进肿瘤血管的形成和生长。由此可知,P450酶可能在乳腺癌中发挥着重要的作用。由于P450酶与骨形成和乳腺癌的发生都有关联,因此,在此项研究中,我的主要目的是探究P450酶在乳腺癌骨转移中所起作用,并进一步研究骨微环境中与P450酶相关的一些关键因子。