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研究目的:支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性呼吸道疾病之一。随着全球气候环境的变化及人们生活水平的改变,全球范围内哮喘的发病率仍在增加,使得该病成为严重的公共健康问题。哮喘是一种慢性气道炎症,以持续性气道炎症、气道高反应性、气道重塑为主要特点。在重症哮喘和难治性哮喘病人中,气道重塑是其重要的病理特点且与疾病的预后密切相关。支气管上皮细胞是机体接触环境中过敏原和有害物质的第一道屏障。接触有害刺激后,支气管上皮细胞可通过上皮间充质转化(EMT)参与气道重塑过程,在哮喘防御机制中发挥重要的作用。因而如何抑制支气管上皮细胞EMT、减轻气道重塑成为哮喘防治的关注重点。Sirtuin是III类组蛋白去乙酰化酶,参与调节能量代谢平衡、细胞抗应激能力、细胞增殖、基因组稳定性和衰老等多种生理过程。越来越多的研究发现Sirtuin在炎症性疾病和纤维化过程中也扮演着重要角色。在急性哮喘的动物模型中,SIRT1及其激动剂具有抗炎作用,而SIRT2具有促炎作用。有研究报道SIRT6在哮喘患者气道刷检标本的支气管上皮细胞中表达升高,因而我们推测SIRT6可能也参与了哮喘的病理过程。但SIRT6在气道重塑过程中的表达情况,及其对气道重塑或支气管上皮细胞EMT的作用尚不明确。针对上述问题,本课题通过建立哮喘气道重塑的大鼠模型,明确气道重塑时SIRT6的表达水平和细胞定位。进一步通过体外实验,探讨SIRT6是否影响气道上皮细胞的EMT过程和EMT相关的细胞生物学行为。最后明确SIRT6影响气道上皮细胞EMT的潜在机制。研究方法:一、建立哮喘气道重塑大鼠模型,检测EMT标志物及SIRT6表达情况1、大鼠哮喘气道重塑模型的建立。40只SD大鼠分为4组:(1)PBS-4周组、(2)OVA-4周组、(3)PBS-8周组和(4)OVA-8周组。第(2)组和(4)组,在实验的第0、7、14天对大鼠腹腔注射OVA和氢氧化铝致敏,从实验21天开始给予大鼠OVA雾化激发,隔日一次,激发持续时间分别为4周、8周。第(1)组和(3)组,用PBS代替OVA对大鼠进行致敏和激发。2、收集气道重塑模型大鼠肺泡灌洗液标本,对肺泡灌洗液中白细胞总数进行计数和各种白细胞的分类计数。3、收集气道重塑模型大鼠肺组织标本进行HE染色和Masson染色观察病理改变;免疫组化染色检测气道上皮细胞中E-cadherin、a-SMA和SIRT6的表达情况。4、使用Western blot方法检测气道重塑模型大鼠肺组织中的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA和SIRT6的蛋白表达水平。PCR方法检测Ecadherin、a-SMA和SIRT6的m RNA表达水平。二、研究SIRT6对支气管上皮细胞EMT、增殖和迁移能力的影响1、体外实验,培养支气管上皮细胞系(16HBE)。用TGF-b1刺激16HBE细胞,使用Western blot和PCR方法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA和SIRT6的表达水平,明确TGF-b1所引起的上皮细胞EMT变化。2、在16HBE细胞中敲低SIRT6,Western blot和PCR方法检测细胞中Ecadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA和SIRT6的表达水平,明确敲低SIRT6是否影响TGF-b1所诱导的细胞中EMT指标变化。在16HBE细胞中敲低SIRT6,通过Transwell和CCK8方法检测细胞的迁移和增殖能力,明确敲低SIRT6是否影响TGF-b1所诱导的细胞迁移和细胞增殖。3、在16HBE细胞中过表达SIRT6,Western blot和PCR方法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA和SIRT6的表达水平,明确过表达SIRT6是否影响TGF-b1所诱导的细胞中EMT指标变化。免疫荧光方法检测Ecadherin、a-SMA表达情况。在16HBE细胞中过表达SIRT6,通过Transwell和CCK8方法检测细胞的迁移和增殖能力,明确过表达SIRT6是否影响TGFb1所诱导的细胞迁移和细胞增殖。4、过表达SIRT6,PCR检测IL-6 m RNA表达水平变化。三、SIRT6减轻支气管上皮细胞EMT、增殖及迁移的机制研究1、在气道重塑哮喘大鼠模型中和TGF-b1诱发EMT的细胞模型中,通过Western blot检测Erk1/2,p-Erk1/2,Smad2,p-Smad2,Smad3和p-Smad3的蛋白表达水平,明确Erk和Smad通路的激活情况。2、在16HBE细胞中过表达SIRT6,通过Western blot检测Erk1/2,pErk1/2,Smad2,p-Smad2,Smad3和p-Smad3的蛋白表达水平,明确SIRT6是否影响Erk和Smad通路的激活。3、在16HBE细胞中过表达SIRT6,通过Western blot和PCR方法检测MMP9和c-Jun的表达水平,通过免疫荧光方法检测H3K9的乙酰化水平。4、通过双荧光素酶报告基因实验,检测SIRT6对c-Jun启动子活性的影响。研究结果:一、在哮喘气道重塑模型中,SIRT6定位于支气管上皮细胞中且表达增多1、哮喘气道重塑的动物模型中,肺泡灌洗液炎症细胞数量增多(P<0.01),以嗜酸性气道炎症为主。病理变化可见气管周围有大量炎症细胞浸润,出现气道壁增厚(P<0.01)、支气管周围平滑肌层增厚(P<0.05)以及气管周围胶原沉积增多(P<0.01)。2、OVA-4周和OVA-8周组气道重塑大鼠肺组织中上皮细胞标志物Ecadherin蛋白水平表达减少(P<0.01),间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和a-SMA蛋白表达水平升高(P<0.05)。模型组肺组织中E-cadherin的m RNA水平表达减少,伴随a-SMA的m RNA水平表达增多(P<0.01)。同时免疫组化结果显示,模型组支气管上皮细胞中E-cadherin减少,伴随a-SMA增多(P<0.05)。说明模型组肺组织和支气管上皮细胞均出现了EMT改变。3、OVA-4周和OVA-8周组大鼠肺组织中SIRT6蛋白表达水平和m RNA表达水平均高于相应的对照组(P<0.01)。免疫组化结果发现,SIRT6在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及炎症细胞中均有表达,但SIRT6在气道上皮细胞中表达最多。气道重塑模型组SIRT6表达水平高于对照组(P<0.05)。二、在16HBE细胞中,过表达SIRT6可抑制TGF-b1所诱发细胞EMT及其增殖和迁移1、经10ng/ml TGF-b1处理16HBE细胞48小时,细胞中E-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.001),N-cadherin、Vimentin和a-SMA蛋白表达水平升高(P<0.05)。细胞形态由多边形、铺路石状变为长梭形,免疫荧光结果显示TGF-b1处理后细胞膜上E-cadherin丢失,同时细胞质中a-SMA表达增多,细胞出现了EMT改变。TGF-b1处理细胞48小时后,16HBE细胞中SIRT6表达显著上调(P<0.05)。2、在16HBE细胞中sh RNA2可显著降低细胞中SIRT6的蛋白表达水平和m RNA表达水平(P<0.001)。但敲低SIRT6并不能影响细胞中TGF-b1诱导的EMT标志物的变化。敲低SIRT6对TGF-b1诱导的细胞增殖和迁移未见显著影响(P>0.05)。3、通过质粒转染和筛选的方式,可显著上调细胞中SIRT6的表达水平(P<0.001)。Western blot结果显示,过表达SIRT6可以抑制TGF-b1诱导的上皮标志物E-cadherin蛋白下调,可以减弱间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和a-SMA蛋白的上调(P<0.05)。PCR结果同样显示,过表达SIRT6可以减弱TGF-b1诱导E-cadherin的m RNA下调,以及N-cadherin、Vimentin和a-SMA的m RNA水平上调(P<0.05)。免疫荧光结果显示,过表达SIRT6可减少细胞膜上E-cadherin的丢失,可抑制细胞质中a-SMA的增多,此外过表达SIRT6还有助于维持细胞上皮样形态。4、过表达SIRT6可以减弱TGF-b1诱导的细胞迁移(P<0.01)。CCK8检测结果显示,过表达SIRT6也可减弱细胞在72小时、96小时及120小时这三个时间点的细胞增殖水平(P<0.05;P<0.05;P<0.01)。5、在16HBE细胞中,过表达SIRT6减少了细胞中EMT相关细胞因子IL-6的m RNA表达水平(P<0.01)。三、SIRT6通过调控Smad3活化和c-Jun表达抑制EMT的机制研究1、在气道重塑模型肺组织中,p-Erk1/2,p-Smad2,和p-Smad3表达水平均高于相应的对照组,提示Erk通路和Smad激活(P<0.05;P<0.05;P<0.05)。在16HBE细胞中,p-Erk1/2,p-Smad2,和p-Smad3表达水平在TGF-b1处理后的24小时及48小时均增高(P<0.05),提示细胞模型中Erk通路和Smad激活。2、在16HBE细胞中,过表达SIRT6可降低TGF-b1所诱导p-Smad3表达(P<0.05),说明SIRT6可以抑制Smad3活化。过表达SIRT6并未影响pErk1/2和p-Smad2的表达(P>0.05)。3、MMP9是影响细胞迁移的重要指标。Western blot结果显示过表达SIRT6可减轻TGF-b1所诱导的MMP9蛋白水平表达(P<0.05)。PCR结果显示过表达SIRT6也可减轻MMP9在m RNA水平的表达(P<0.05)。4、c-Jun可促进MMP9的转录,在SIRT6过表达细胞中,c-Jun的蛋白和m RNA表达水平均降低(P<0.05;P<0.05)。同时实验结果发现,细胞中H3K9的乙酰化水平显著降低。通过双荧光素酶报告基因实验结果显示,SIRT6可抑制c-Jun启动子转录活性(P<0.05)。提示SIRT6可能通过抑制c-Jun转录,下调c-Jun表达,从而抑制MMP9表达。研究结论:1、在哮喘气道重塑模型中,SIRT6主要定位于支气管上皮细胞中。该模型中SIRT6表达增多伴随着气道上皮细胞EMT表现。2、在16HBE细胞中,TGF-β1可上调SIRT6。过表达SIRT6可抑制TGF-β1所诱导上皮标志物丢失、抑制间质标志物增多,并有助于维持上皮细胞形态;SIRT6可抑制TGF-β1所诱导细胞增殖和细胞迁移。SIRT6还可抑制细胞中IL-6的表达。3、SIRT6通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路抑制细胞EMT。SIRT6可减少组蛋白H3K9乙酰化,抑制c-Jun启动子活性降低c-Jun表达,这可能是SIRT6抑制细胞增殖和迁移的机制之一。