癫痫是一种常见的神经性疾病,以反复的、自发的癫痫发作为临床特征。癫痫发作是由大脑皮层神经元的超同步异常放电导致脑功能暂时性紊乱的一种现象。癫痫具有很高的发病率和致死率,然而癫痫的病因和发病机理还不是很清楚。可能导致癫痫的病因有很多,比如遗传因素、后天获得因素以及刺激因素等等。单基因突变可以导致特发性癫痫,而这些单基因中有很大一部分是编码离子通道的基因,其中包括电压门控型的钾离子通道、钠离子通道和钙离子通道,还有烟碱型乙酰胆碱受体和GABAA型受体等等。之前,我们实验室报道了KCNMA1基因上的一个突变p.D434G可以导致全身性癫痫和阵发性运动障碍(GEPD),第一次把KCNMA1基因和癫痫关联了起来。KCNMA1基因编码的BK通道是一种可以同时被钙离子和电压激活的大电导钾离子通道。BK通道广泛表达于机体的各种组织和细胞中,参与了许多重要的生理过程,比如神经递质的释放,平滑肌的收缩和耳蜗毛细胞的调谐等等。BK通道的电压敏感器位于S4跨膜片段,钙离子敏感位点存在于胞质内的两个RCK结构域中。p.D434G突变导致GEPD的分子机制是,它通过提高BK通道的钙离子敏感性进而增强了通道的激活特性。本次研究中,我们一共收集到了四个KCNMA1基因的突变,c.2984A>G(p.N995S)、c.3476A>G(p.N1159S)、c.1967A>C(p.E656A)和c.1554G>T(p.K518N),它们分别是从五名相互独立的癫痫患者中被鉴定出来的,这些病人没有阵发性运动障碍。其中c.2984A>G(p.N995S)这个突变分别以新发突变(de novo mutation)的形式发生在两个独立的癫痫患者中,从遗传学的角度而言,强力支持该突变和癫痫存在关联。然而,突变基因的功能研究对于判断一个突变到底是否能够致病尤为重要,所以我们把这些突变分别引入到BK通道的表达质粒上,然后转染到HEK293细胞中进行表达,运用膜片钳技术,通过记录宏观电流和单通道电流来研究这些突变型通道的电生理性质,从而揭示BK突变导致癫痫的分子机制。结果表明,在10μM的胞内钙离子浓度下,p.N995S突变可以使BK通道的激活GV曲线朝着负电压的方向偏移59 mV,但是另外三个突变对BK通道的功能并没有影响。而且,在BK通道的β4亚基存在的情况下,p.N995S突变依然可以使BK通道的激活GV曲线朝着负电压的方向偏移71 mV。这说明了p.N995S这个突变应该是通过增强BK通道的激活特性引发癫痫,而另外三个突变只是良性的变异,和癫痫之间应该没有什么关联。考虑到之前的p.D434G突变是通过增加通道的钙离子敏感性来增强通道的激活特性,并且p.N995S突变位于通道的RCK2结构域,所以我们接下来对p.N995S突变型通道的钙离子敏感性进行了研究。结果表明,p.N995S突变对BK通道激活的增强程度在不同的钙离子浓度下是类似的,并且当通道的钙离子结合位点被突变掉之后(p.2D2A/p.5D5N),p.N995S依然可以增强通道的激活特性。这些结果说明了p.N995S突变并不影响BK通道的钙离子敏感性。之后,我们通过分析单通道电流,发现p.N995S突变可以增加BK通道的单通道开放机率和单通道开放驻留时间。从我们的实验数据推测出,p.N995S可以增强BK通道的电压激活和孔道开关之间的变构耦合作用,并且可以稳定通道的开放态构象。另外,BK通道的选择性抑制剂蕈青霉素对野生型和p.N995S突变型通道皆有阻断作用,这个结果指出了BK通道的抑制剂可以被用来设计药物,治疗那些由BK通道活性异常增强而导致的癫痫。总结,我们在BK通道上鉴定出了可以引起癫痫的第一个新发突变p.N995S。与之前的p.D434G突变相比,携带p.N995S突变的患者只表现出癫痫,并没有阵发性运动障碍。虽然这两个突变都可以增强BK通道的激活特性,但是却有着不同的分子机制。p.D434G突变是通过增加钙离子敏感性来增强通道的激活特性,而p.N995S突变是通过增加单通道开放机率和单通道开放驻留时间来增强通道的激活特性,并且p.N995S突变不影响通道的钙离子敏感性。我们的研究结果进一步验证了BK通道和癫痫的相关性,为癫痫的遗传诊断提供了理论依据,并且指出了电生理研究对于判断通道突变是否致病的重要性。我们建议,可以把BK通道作为药物靶点,从BK通道的抑制剂中来筛选设计抗癫痫药物,另外可以把p.N995S突变当作工具来研究BK通道的结构和门控机制。