[背景]间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是由多种病因所致的弥漫性肺实质、肺泡炎症,以及间质纤维化为病理特征的一类疾病。约35%~45%ILD与结缔组织病(connective tissue diseases,CTD)相关,而CTD相关性ILD(CTD-ILD)患病率可高达60%以上。肺纤维化是CTD-ILD的终末结局,一旦发生肺纤维化,严重影响CTD患者的生存和生活质量。CTD相关肺纤维化的发病机制尚不明确,涉及免疫调节紊乱及炎症,多种免疫细胞、细胞因子、肺泡上皮细胞和肺成纤维细胞、炎症介质、细胞外基质以及转化生长因子β1(transforming-growth factor beta 1,TGF-β1)信号转导通路等参与其发病,但不能完全阐释该病的发生发展。随着氧化应激与肺纤维化及CTD研究的不断深入,氧化应激在CTD相关的肺纤维化发病中的作用及发病机制值得进一步的研究。BTB-cap‘n’collar(CNC)同源异构体1[BTB(broad-complex,tramtrack and bric-a-brac)and CNC(cap’n’collar protein)homology 1,Bach1]是CNC家族的一种转录抑制因子,通过竞争性抑制核因子E相关因子2(nuclear factor-erythroid-related factor 2,Nrf2)参与氧化应激的调节,而Nrf2是机体抗氧化反应的中枢调节者,通过刺激其下游的抗氧化因子的产生来增加组织细胞氧化应激能力,抑制肺纤维化的进展,提示Bachl可能参与肺纤维化的发病。目前国内外尚缺乏Bachl与CTD相关肺纤维化发病的关系及作用机制的研究。因此,本研究选择Bachl为靶点,采用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)技术沉默Bachl基因,体外研究采用TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞模拟纤维化的细胞模型,体内研究则采用博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模拟CTD相关肺纤维化的动物模型,观察Bachl si RNA对TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞及博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的氧化/抗氧化能力及纤维化进程的影响,初步探讨Bachl在CTD相关肺纤维化发病中的作用及Bachl si RNA对CTD相关肺纤维化的抗氧化效应及治疗作用。[目的]本研究基于氧化应激参与肺纤维化的发病及Bachl对氧化应激的调节作用,研究Bachl在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠发病中的作用及机制,探讨Bachl与CTD相关肺纤维化的关系及其作为CTD肺纤维化治疗靶点的可能性。[方法]1.Bach1 si RNA重组腺病毒的构建构建两段Bach1 si RNA腺病毒载体及一段空病毒载体,酶切及基因测序鉴定是否与设计的序列一致,构建后的重组腺病毒转染小鼠肺成纤维细胞,荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)及蛋白质印迹法(western blot,WB)检测Bach1 m RNA和蛋白表达来观察沉默效率。2.细胞实验培养小鼠肺成纤维细胞,接种密度1×105/m L,细胞分五组:空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+空载体组,TGF-β1+Bach1#1 si RNA组及TGF-β1+Bach1#2si RNA组,细胞饥饿培养24h,更换含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培养基,空白对照组不予处理,TGF-β1组的细胞给予5ng/m L TGF-β1处理72h,TGF-β1+空载体组的细胞给予5ng/m L TGF-β1处理24h后给予感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50的空病毒载体转染48h,TGF-β1+Bach1#1si RNA组的细胞给予5ng/m L TGF-β1处理24h后给予50 MOI的Bach1#1 si RNA转染48h,TGF-β1+Bach1#2 si RNA组细胞给予5ng/m L TGF-β1处理24h后给予50 MOI的Bach1#2 si RNA转染48h。CCK8检测细胞的增殖能力;RT-PCR及Western blot分别检测细胞中Bach1、血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化酶1及NAD(P)H苯醌氧化还原酶1的m RNA和蛋白表达水平。酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及Ⅰ型胶原的水平,并分析小鼠肺成纤维细胞中Bach1的表达水平与细胞增殖能力、抗氧化因子和参与纤维化进程的因子表达水平之间的关系。3.动物实验7-8周龄雄性近交系C57BL/6小鼠40只,随机分为四组,对照组、博来霉素组、博来霉素+空载体组、博来霉素+Bach1 si RNA组,每组10只,后三组采用博来霉素(5.0 mg/kg)气管内注射,对照组小鼠气管内注射与模型组小鼠等体积的0.9%生理盐水,博来霉素+空载体组、博来霉素+Bach1 si RNA组小鼠成功造模后分别尾静脉注射空载体(1×109pfu)及体外实验优选的Bach1 si RNA腺病毒载体(1×109pfu),两天1次,共注射2周。于干预终点处死小鼠,留取血清、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺组织,RT-PCR及Western Blot检测小鼠肺组织中Bach1及抗氧化因子血红素加氧酶1、谷胱甘肽过氧化酶1及NAD(P)H苯醌氧化还原酶1的m RNA及蛋白表达;ELISA检测血清及BALF中IL-6及Ⅰ型胶原的水平;病理苏木精伊红(hematoxylin and eosin,HE)及马松(Masson)染色观察肺组织炎症及纤维化程度,并分析肺组织中Bach1的表达水平与抗氧化因子、参与纤维化进程的因子以及肺组织炎症及纤维化评分之间的相关性。4.统计分析实验数据采用SPSS 17.0进行统计分析,结果以均数±标准差(X±S)表示,多个组间的比较采用单因素方差分析;若方差齐,组内两两之间的比较采用LSD检验,若方差不齐,组内两两比较则采用Tamhane检验;相关性分析正态分布资料应用Pearson相关,非正态分布资料应用Spearman秩相关。P≤0.05认为差异有统计学意义,P≤0.01认为差异有显著统计学意义,而P>0.05认为差异无统计学意义。[结果]1.Bach1 si RNA腺病毒载体的成功构建基因测序结果与本研究设计的Bach1 si RNA序列完全相同;荧光检测及流式细胞术结果表明两段Bach1 si RNA对小鼠肺成纤维细胞的转染效率达到90%以上,RT-PCR的结果表明两段Bach1 si RNA转染小鼠肺成纤维细胞后沉默效率达到70%以上,Western blot结果也显示两段Bach1 si RNA转染小鼠肺成纤维细胞后,Bach1蛋白表达明显抑制,以Bach1#1 si RNA更为明显。2.Bach1 si RNA对TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞的作用2.1 Bach1 si RNA对TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞增殖能力的影响CCK8结果表明:TGF-β1处理后48 h及72 h,小鼠肺成纤维细胞的增殖能力较空白对照组明显升高(0.50±0.03与0.44±0.02及0.92±0.02与0.65±0.01,P均≤0.05),但两段Bach1 si RNA干预后48 h,增殖能力较TGF-β1组相比则明显下降(0.33±0.00与0.50±0.03以及0.35±0.05与0.50±0.03,P均≤0.01),差异有统计学意义。2.2 Bach1 si RNA对TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞中抗氧化因子表达的影响RT-PCR的结果表明,TGF-β1处理后,与空白对照组相比,小鼠肺成纤维细胞中Bach1 m RNA的表达明显升高(2.13±0.09与1.00±0.07,P≤0.05),而血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1的m RNA表达则明显降低(0.40±0.04与1.00±0.02及0.57±0.11与1.00±0.26,P≤0.05及P≤0.01);但Bach1 si RNA干预后,与TGF-β1组相比,Bach1 m RNA表达明显下降(0.15±0.02与2.13±0.09,P≤0.01),而血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1的m RNA表达明显升高(3.30±0.29与0.40±0.04及1.84±0.23与0.57±0.11,P≤0.05及P≤0.01),差异有统计学意义。TGF-β1及Bach1 si RNA干预后,与对照组相比,NAD(P)H苯醌氧化还原酶1m RNA表达之间的差异无统计学意义(0.78±0.15,0.75±0.06与1.00±0.29,P均>0.05)。Western blot结果显示TGF-β1促进小鼠肺成纤维细胞中Bach1蛋白的表达,但抑制血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1的蛋白表达;Bach1 si RNA干预后,与TGF-β1组及TGF-β1+空载体组相比,Bach1蛋白表达明显抑制,但血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1蛋白表达则明显升高;TGF-β1及Bach1si RNA干预后NAD(P)H苯醌氧化还原酶1蛋白的表达与空白对照组无明显差异。2.3 Bach1 si RNA对TGF-β1诱导后的小鼠肺成纤维细胞中IL-6及Ⅰ型胶原表达的影响ELISA的结果表明:TGF-β1处理小鼠肺成纤维细胞后,与空白对照组相比,细胞上清中纤维化进程相关细胞因子IL-6及细胞外基质Ⅰ型胶原的表达明显升高(33.62±5.72与20.29±4.88及32.77±4.04与23.40±2.36,P均≤0.01);但Bach1si RNA转染细胞,与TGF-β1组相比,细胞上清中IL-6及Ⅰ型胶原表达则明显下降(11.11±3.17与33.62±5.72,P≤0.01及25.52±2.16与32.77±4.04,P≤0.05),差异有统计学意义。2.4 MLF中Bach1的表达与细胞增殖水平、抗氧化因子及纤维化进程相关因子表达之间的关系相关性分析结果表明小鼠肺成纤维细胞中Bach1的表达水平与细胞增殖水平呈正相关(r=0.40,P≤0.01),与纤维化进程相关因子IL-6及Ⅰ型胶原的表达水平也呈正相关(r=0.79及r=0.57,P均≤0.01),但与小鼠肺成纤维细胞中抗氧化因子血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1的表达水平呈负相关(r=-0.79及r=-0.64,P均≤0.01),差异有显著统计学意义;但Bach1的表达水平与NAD(P)H苯醌氧化还原酶1的表达水平之间无明显相关性,差异无统计学意义(r=-0.13,P>0.05)。3 Bach1 si RNA对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的作用3.1 Bach1 si RNA对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中抗氧化因子表达的影响RT-PCR及Western blot结果显示:与对照组小鼠相比,博来霉素组小鼠肺组织中Bach1 m RNA表达(2.34±0.15与1.00±0.13,P≤0.05)及蛋白表达明显升高,而血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1 m RNA的表达(0.54±0.06与1.00±0.37,P≤0.05及0.30±0.02与1.00±0.15,P≤0.01)及蛋白的表达明显减低;Bach1-si RNA处理后,与博来霉素组相比,肺组织中Bach1 m RNA(0.32±0.06与2.34±0.15,P≤0.01)及蛋白表达明显下降,血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1m RNA(1.94±0.19与0.54±0.06及2.07±0.09与0.30±0.02,P均≤0.05)及蛋白表达则明显升高,差异有统计学意义;与对照组相比,博来霉素及Bach1 si RNA处理后小鼠肺组织中NAD(P)H苯醌氧化还原酶1 m RNA(0.80±0.07与1.00±0.26及0.79±0.07与1.00±0.26,P均>0.05)及蛋白表达之间的差异无统计学意义。3.2 Bach1 si RNA对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠血清及BALF中IL-6及Ⅰ型胶原表达的影响ELISA结果表明:与对照组相比,博来霉素组小鼠血清及BALF中IL-6(43.99±5.10与8.71±2.42及11.69±2.08与2.15±0.51,P均≤0.01)及Ⅰ型胶原(82.22±6.46与70.39±1.56,P≤0.05及5.50±0.54与2.53±0.12,P≤0.01)蛋白表达明显升高,差异有显著统计学意义;与博来霉素组相比,Bach1-si RNA组血清及BALF中IL-6(12.88±2.93与43.99±5.10及1.83±0.37与11.69±2.08,P均≤0.01)以及Ⅰ型胶原(72.55±2.73与82.22±6.46,P≤0.05及3.85±0.78与5.50±0.54,P≤0.01)的蛋白表达则明显降低,差异有统计学意义。3.3 Bach1-si RNA对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠病理形态改变的影响博来霉素造模后14天,肺CT及病理改变符合肺纤维化的影像和病理改变,模型成功后给予Bach1-si RNA干预,于14天后与博来霉素组相比,HE染色可见小鼠肺泡间质炎细胞浸润及肺泡结构破坏程度较博来霉素组有所减轻;Masson染色可见间质蓝染的胶原纤维明显减少,肺泡炎症及纤维化程度明显减轻(1.90±0.12与3.30±0.25及2.80±0.37与4.60±0.51,P均≤0.01),差异有显著统计学意义。3.4小鼠肺组织中Bach1的表达与抗氧化因子、参与纤维化进程的因子及病理改变的相关性分析的相关性分析相关性分析结果表明:小鼠肺组织中Bach1的表达水平与抗氧化因子血红素加氧酶1及谷胱甘肽过氧化酶1的表达水平呈负相关(r=-0.69及r=-0.56,P均≤0.01);Bach1的表达水平与血清和BALF中IL-6(r=0.62及r=0.65,P均≤0.01)和Ⅰ型胶原的表达水平(r=0.61及r=0.54,P均≤0.01)以及肺泡炎和纤维化评分呈正相关(r=0.35及r=0.33,P均≤0.05),差异有统计学意义;Bach1的表达水平与NAD(P)H苯醌氧化还原酶1的表达水平之间无明显相关性,差异无统计学意义(r=-0.06,P>0.05)。[结论]1、TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞中及博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中Bach1表达明显升高。2、沉默Bach1抑制小鼠肺成纤维细胞的增殖、抑制小鼠肺成纤维细胞和肺组织中纤维化进程相关因子的表达,促进抗氧化因子的表达。3、Bach1的表达与抗氧化因子水平呈负相关,与小鼠成纤维细胞增殖能力、纤维化进程相关因子、肺泡炎和纤维化的程度呈正相关。4、Bach1通过调节氧化应激,参与肺纤维化的发病和进展,为深入研究CTD相关肺纤维化的作用机制及筛选治疗靶点提供实验依据。