研究背景肝癌在我国的发病率高，疗效差。相当比例的肝癌患者就诊时即呈现多发病灶，而肝癌多发的来源有两个：多中心发生和肝内播散。这两种类型肝癌的治疗方式和预后明显不同，前者只要进行积极的手术治疗，术后控制肝炎、肝硬化、保护肝功能，一般预后较好；而后者术后主要针对肝内微小转移灶的治疗，如局部化疗栓塞等的综合治疗，且预后不良。目前临床对于这两种类型肝癌的鉴别主要依据临床病理和影像资料，而利用分子遗传学结果进行鉴别的研究较少。虽然日本有一些分子遗传学方面的报道，但主要针对丙型肝炎相关的肝癌，不适合我国以乙型肝炎病毒相关的肝癌为主的国情。研究目的探讨多发肝癌在多中心发生和肝内转移方面的发病情况和鉴别两种类型肝癌的理想方法。研究方法1．收集我院经手术切除的多发肝癌患者的临床病理资料，通过病理学特征的观察和p53和骨桥蛋白的免疫组织化学染色初步鉴别多发肝癌的类型，统计学分析两组病例的差异因素和预后。2．收集多发肝癌患者的新鲜组织标本，提取基因组DNA，PCR扩增每个瘤灶的微卫星标志物，应用微卫星多态性技术检测标志物的杂合性缺失和微卫星不稳定性情况，通过这些遗传信息推断每位患者多发瘤灶间的克隆系关系。3．在多发肝癌患者的基因组DNA中检测乙肝病毒的基因整合情况，对于阳性的病例，进一步应用Southern Blotting方法检测每位多发肝癌患者中各瘤灶间乙肝病毒DNA整合位点的异同，推断瘤灶间的克隆系关系。4．综合比较上述各方法的判别结果，评价各自的应用价值。研究结果1．(1)组织学观察结合p53和骨桥蛋白的免疫组织化学染色结果，89例多发肝癌患者中，16例(18.0％)为多中心发生，57例(64.0％)为肝内转移，5例包含两种类型的多发结节，11例不能明确分型；(2)逐步回归多因素分析显示肿瘤分级、肿瘤大小、胆碱酯酶、Child’s分级、门静脉侵犯在两组间差异显著；(3)多中心发生型多发肝癌患者的预后好于肝内转移型患者；(4)多发肿瘤类型(多中心发生或肝内转移)和Child’s分级是独立预后因素。2．(1)10个微卫星标志物在35例多发肝癌患者的79个瘤结节中杂合性缺失率和微卫星不稳定性的发生率分别约为35％和10％；(2)通过比较瘤灶间的遗传信息，发现多中心发生的发生率为14.3％(5／35)，肝内转移的患者为82.9％(29／35)，1例包含两种类型的瘤灶。3．(1)35例多发肝癌患者中，97.1％(34／35)有HBV-X的整合，包括3例血清HBs-Ag阴性的患者；(2)HBV-X的整合位点分析显示16.1％(6／34)的患者为多中心发生，71.0％(27／34)的患者为肝内转移，既有多中心发生又有肝内转移瘤灶的病例比例为12.9％(1／34)；(3)相关性分析显示Child’s分级、瘤灶位置、肿瘤大小和肿瘤分级与由Southern Blotting获得的多发肝癌的类型显著相关(P＜0.05)。4．(1)综合分析临床病理学和分子遗传学结果，35例多发肝癌患者中17.1％(6／35)为MO，80％(28／35)为IM，2.9％(1／35)的病例含有两种类型的肝癌；(2)HBV整合位点分析与最终的判定结果的一致性最高(r_s=0.949，P＜0.001)，微卫星多态性的一致性次之(r_s=0.829，P＜0.001)，病理学观察方法的一致性较低(r_s=0.319，P=0.06)，免疫组化染色与最终结果没有明显的相关性(r_s=0.214，P=0.22)；(3)HBV整合位点与微卫星多态性分析的结果具有显著的相关关系(r_s=0.787，P＜0.001)；(4)Child’s分级(P=0.015)、肿瘤组织学分级(P=0.018)和有无卫星结节(P=0.046)在最终判定的IM和MO组中差异显著。结论1．本院收治的多发肝癌，以肝内转移型肝癌为主(＞70％)，多中心发生型肝癌比例较低(＜20％)。这与日本不同，可能是与HBV和HCV导致的肝硬化程度和致癌机制不同有关。2．多中心发生型肝癌患者的预后优于肝内转移患者。对于多中心发生患者，应积极行手术治疗，同时注意保护肝功能。3．在两种类型肝癌的鉴别方面：(1)除了日本研究者报道的判别多中心发生和肝内转移的标准外，多发肝癌的组织学亚型不同提示多中心发生的可能性较大。p53和骨桥蛋白的免疫组化染色对于多中心发生和肝内转移的鉴别意义有限，有待于寻找较为敏感的指标。(2)在多发肝癌中，微卫星多态性主要表现为杂合性缺失，但微卫星不稳定性也可提供有价值的遗传信息。对多发肝癌患者，术前可行穿刺活检并进行微卫星多态性分析，推断瘤灶的克隆系来源，指导治疗方案的选择。(3)肝癌的发生、发展过程中持续存在HBV感染，产生新的整合位点。常规的血清学检测HBV阴性的患者，也可能存在HBV DNA的整合，因此HBV整合位点分析不仅可用于HBs抗原携带者，而且还可用于一些HBs抗原血清学阴性的患者。使用Southern Blotting技术检测HBV整合位点，推测多发肝癌的克隆系来源，有助于鉴别多中心发生和肝内转移。(4)利用Southern Blotting检测HBV DNA整合位点对于HBV阳性多发HCC的判别的准确性最高。微卫星多态性技术检测结果可以与HBV DNA整合位点分析相互补充、印证。这两种分子遗传学方法虽然比较准确，但是不适于现阶段临床广泛应用。临床医生可以通过Child’s分级、肿瘤组织学分级和有无卫星结节粗略地鉴别多发肝癌的类型。4．利用临床病理学和分子遗传学结果确定足够的多中心发生和肝内转移病例，建立仅包括临床病理参数的判别公式，是本研究下一步要解决的问题。