西瓜裂刻叶基因ClLL1的精细定位及克隆

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叶缘裂刻是植物适应环境(尤其是逆境)的一种表现,在生产上有很多应用优势,例如提高植物的抗旱、抗寒及对强风的抵御能力。西瓜是葫芦科重要的经济作物,其叶形为裂刻叶。开展对西瓜叶型调控基因的精细定位与克隆的研究,对认识叶形发育及改良西瓜抗旱品种具有重要意义。本研究以西瓜商品种“1101”自交获得的分离群体为材料,观察了叶形的形态学特征,遗传分析表明西瓜叶缘裂刻是由单基因控制的显性性状,命名为ClLL1(Citrullus lanatus Lobed Leaf 1);通过BSR-seq技术,完成对叶缘裂刻基因ClLL1精细定位,确定ORF5(Cla018360)为候选基因,并对其进行生物信息学分析及克隆。主要取得以下结果:1.群体叶片形态统计发现,叶片形状在第三片真叶出现以后就可明显区分,在第六片真叶期有显著差异。此外,第六片真叶期后,全缘叶植株中可观察到明显的对称状边缘突起。2.F2:3群体植株自交,每株单独收种,构建可用于叶缘性状遗传分析与基因定位的F3:4群体。以小比例F3:4子代统计叶缘形态的分离情况,结果显示,F3:4群体叶片呈现出两个表型,包括69个裂刻叶植株和24个全缘叶植株,符合孟德尔遗传分离比3:1(χ2=0.03,p=0.86),此外,全缘叶F2:3个体的幼苗叶片形状与亲本一致,未发生分离。综上所述,我们推断,西瓜裂刻叶的叶片形态由显性单基因控制,命名为ClLL1。3.本研究采用了BSA和RNA测序相结合的方法鉴定基因组中的SNP和indels位点,共选择了5966个可靠的SNP和indels位点用于开发标记。4.根据等位SNP在两个测序数据中的测序频率差异,将ClLL1定位至4号染色体。连锁分析显示,4号染色体上的标记W01144与裂刻叶性状连锁,随后,开发新的标记筛选重组体,将基因初定位于W03041和W01214标记之间,物理距离为2.64 Mb。5.利用W03041和W01214标记扫描扩大的分离群体(2455株),鉴定重组体,在初定位区间设计13个标记扫描上述重组体,将基因精细定位到W07164和W07061标记之间,物理距离约为29.14-kb,遗传距离为0.48 cM。6.在精细定位区间内,共有5个开放阅读框(ORF),结合基因注释文件、序列分析以及与标记的遗传距离分析,最终确定ORF5(Cla018360,编码一个类亮氨酸拉链同源域蛋白)为候选基因。7.利用实时荧光定量PCR分析候选基因Cla018360在裂刻叶和全缘叶中的表达,结果表明,幼嫩裂刻叶片中的Cla018360表达量比全缘叶高出9倍以上,证明Cla018360基因对于裂刻叶的形成有重要作用。进一步检测裂刻叶植株不同组织的基因表达量,结果表明,基因在这些组织中均有表达。8.经过PCR电泳检测和测序证实,成功克隆了候选基因Cla018360的全长cDNA序列。亚细胞定位试验表明,Cla018360定位于细胞核中。进化分析表明该基因为拟南芥基因LMI1的同源体,同属于HD-zipⅠ转录因子亚家族成员。9.利用同源重组技术,构建了pCAMBIA2300-Cla018360超表达载体,并成功转入农杆菌中,以备后续进行基因功能验证。
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