论文部分内容阅读
目的:本研究旨在构建中性粒细胞激活蛋白原核表达质粒,通过原核表达获得纯化重组幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白;以卵清蛋白(OVA)诱导小鼠建立哮喘动物模型;并使用重组HP-NAP(rNAP)对模型小鼠进行干预,探索重组HP-NAP在哮喘防治方面的作用及机制。 方法:目的基因的扩增、克隆及序列分析——取幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1全基因组DNA为模板,用根据GenBankHPSS1NAP(AF227072)序列设计的特异性引物NAP/P1、P2,通过PCR技术扩增NAP基因,PCR产物纯化后将其克隆入原核表达载体pET-28a(+),连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5a,挑取经卡那霉素筛选的阳性菌落提取质粒,进行双酶切、PCR鉴定及测序分析。 目的蛋白的表达、纯化及抗原性分析——将提取的质粒转化大肠杆菌E.coliBL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹法(WesternBlot,WB)分析表达结果。使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。SDS-PAGE确定纯化蛋白中无杂带后使用BCA法测定蛋白浓度。使用纯化蛋白免疫大鼠,得到抗血清,测定抗血清滴度并进行WB分析蛋白抗原性。并使用纯化的重组NAP包被ELISA板,对HP感染病人血清进行NAP特异性IgM检测。 动物造模与rNAP干预处理——于第1、7天给6周BALB/c小鼠注射/吸入rNAP,第14天开始按动物造模手册中的标准方法进行小鼠哮喘造模,至第46天造模完毕,24-48小时内完成采血、收集肺泡灌洗液及肺组织等标本收集。随后完成血清IgE水平、肺泡灌洗液中细胞炎症因子水平的测定及观察肺组织切片中的组织病变情况。 结果:PCR扩增出大小约430bp左右的片段并将其成功克隆入pET-28a(+)载体。序列比对分析显示NAP开放阅读框长435bp,预测编码144个氨基酸,分子量为16904.92,等电点为5.69。经NCBIBLAST比对与幽门螺杆菌J99株和51株比对相符度均达99%。本实验成功构建高效表达载体pET-28a(+)-NAP,并获得分子量约17kDa的可溶性融合表达蛋白。用该蛋白免疫大鼠获得多克隆抗血清效价高达1:51200,蛋白印迹阳性证明其免疫原性及免疫反应性均很强。纯化的rNAP包被ELISA板,对HP感染病人血清进行NAP特异性IgM检测,敏感度与特异度分别为91.89%和85%。 将经纯化的rNAP分别通过腹腔注射/雾化吸入方式作用于小鼠哮喘模型,结果表明与模型相比,两种途径给药均可上调促Th1反应的IFN-γ在肺组织细胞中的分泌,与模型组间差异具有统计学差异;并减缓小鼠的哮喘相关指征,明显降低肺组织的嗜酸性粒细胞积累、炎症细胞浸润程度及粘膜增厚等典型过敏性炎症,抑制血清中总IgE水平(P<0.01),差异具有统计学意义;过敏相关的Th2炎症因子IL-4、IL-13水平显著低于模型组水平(P<0.01),差异具统计学意义。 结论:成功克隆、表达了HP-NAP基因,并得到了纯化的rNAP蛋白,且纯化蛋白具抗原性及免疫原性;rNAP能有效抑制和缓解OVA诱导的小鼠哮喘模型中的炎症反应和肺组织病变情况。