背景：关节表面透明软骨组织具有无神经、无血管的解剖结构特征以及缓冲承受人体压力的功能特征,其自我修复和再生能力很差。而关节软骨缺损是一类常见疾病,常由运动损伤造成,患者多为年轻人,运动员尤为常见。缺损软骨长期磨损会导致退行性的骨关节病变,随时间推移发展为全骨关节炎。我国骨关节炎的患者约有1亿入且呈不断增加趋势,其中85-90%都采取保守治疗,10-15%的严重骨关节炎患者需置换人工关节。由于极高的患病率和致残率,昂贵的治疗费用,疾病所致的工作能力和生活能力的丧失,骨关节炎已成为造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一目前临床治疗骨关节炎主要采用对症治疗,关节镜下关节腔冲洗,骨髓刺激或自体软骨块移植,这些方法各有利弊。对症治疗,关节腔冲洗,骨髓刺激等处理方式效果迅速而显著,但有效持续时间短暂；自体软骨块移植适合于小面积缺损,但移植的软骨块不能与周围的软骨愈合,长期疗效无法确定。近10年随着组织工程的兴起,临床医学正步入“再生医学”的新阶段。临床上已成功利用自体软骨细胞进行缺损软骨组织的再生治疗。种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程修复再生的三大主导因素。在利用组织工程化软骨再生的过程中,决定其成败的首要因素是种子细胞。利用自体软骨细胞移植有诸多限制,首要问题是成体软骨细胞来源有限。软骨细胞属于增殖能力极弱的终末分化的细胞,在体外培养过程中发生去分化现象,丧失其成软骨能力,因此难以用少量的成体软骨细胞经体外培养扩增获得大量有正常功能的软骨细胞,从而限制了自体软骨组织工程的临床应用。其次是,由临床自体软骨细胞关节移植病例的追踪和回访结果发现,在体内关节修复部位,活检组织中的均一性透明软骨的比例为40-60%,纤维软骨的比例占30%-40%,这可能是由于植入的软骨细胞的个体性能差异,有些细胞能够形成透明软骨,有些只形成纤维软骨。因此,如何提高均一性透明软骨在修复软骨中的比例也是自体软骨组织工程临床应用的难题。为解决种子细胞来源不足的问题,干细胞(Stem Cell)凭借其自我更新能力(Self renewal)和多向分化潜能(Pluripotent)的特征,吸引研究者的视线。胚胎干细胞和iPSCs具有软骨分化能力,有治疗软骨缺损的可能性,研究还处于初期阶段。成体干细胞用在软骨组织再生的研究集中在滑膜和骨髓来源的干细胞。有研究表明,软骨组织中可能存在具有多能特性的干细胞：将软骨细胞在体外低密度种植,有部分细胞表现出成集落的特性。2009年Koelling S所在的德国研究组在定义了软骨祖细胞(CPC, Cartilage Progenitor Cell),该研究将从末期关节炎(OA, Osteoarthritis)的软骨组织中分离出来的具有祖细胞特征的细胞称为软骨祖细胞。在这一研究中无法为CPC提供明确的分离标记,在正常软骨组织中遵循其定义则无法分离出CPC。正常软骨组织中是否有干细胞?其干细胞是何种来源,有何种特性?人们对软骨组织中的这些多能干细胞的特性、起源及其应用前景都不清楚。本研究中着重关注了软骨干/祖细胞的存在、特征、起源，以及调控软骨干祖细胞生长分化的因素以及其临床应用的探索。而这些科学问题的明晰将有助于认识软骨组织的干/祖细胞,从新视角了解骨关节软骨的病理生理以及提升软骨缺损的细胞治疗质量。具体研究分为五部分：(1)种子细胞(CSPCs)的分离和鉴定；(2)CSPCs的起源和特征；(3)CSPCs的生长分化调控,CSPCs在炎症条件下的病理反应及对策的研究；(4)构建组织工程化软骨：包括生物活性支架材料的选择、BMP家族中软骨生长因子的优化、利用软骨干/祖细胞构建组织工程软骨；(5)组织工程化软骨的临床应用。第一章种子细胞(CSPCs)的分离和鉴定研究目的：软骨干/祖细胞是近年发现的,来源于软骨组织的干细胞。本部分的目的是研究软骨干/祖细胞的分离收获方案及与骨髓来源的间质干细胞(hBMSC)相比较,检测其表面标记表达谱,和三系分化能力有何异同。方法与结果：在体外试验中,我们优化了软骨干/祖细胞的培养方案,评估了软骨干/祖细胞的克隆形成能力,并与骨髓来源的间质干细胞定量比较了三系分化能力。结果显示,1)低密度、低葡萄糖浓度的培养条件能够促进软骨干/祖细胞的增殖。2)软骨干/祖细胞符合间质干细胞的特征,包括表达特定的间质干细胞表面标记物,具有克隆形成能力,具有间质三系分化潜能。3)与骨髓来源的间质干细胞相比,软骨干/祖细胞成软骨能力有优势,而骨系和脂肪系分化能力则不如骨髓来源的间质干细胞。结论：来源于软骨组织的软骨干/祖细胞(CSPCs)具有间质干细胞的共性和一些软骨组织特性,可能是体内软骨修复的理想外源性种子细胞来源。第二章软骨干/祖细胞的动态特征研究目的：研究软骨干/祖细胞在正常人和骨关节炎(Osteoarthritis, OA)患者的软骨组织内的起源过程及其动态变化特征。方法与结果：收获正常人和骨关节炎的软骨组织,在组织学和细胞学水平,分别对软骨组织的特异性基质蛋白、间质干细胞的表面标志以及骨关节炎/CSPCs相关标志物进行检测。我们发现,1)正常人和骨关节炎的软骨组织中细胞的二型胶原表达均为阳性,CD146的表达均为阴性,但Stro-1和CD271则仅表达于骨关节炎软骨组织中；2)无论是正常人或骨关节炎来源的软骨,CSPCs细胞在分离和传代过程中,透明软骨特征蛋白二型胶原的表达在逐渐递减,而间质干细胞的初期表面标志CD146的表达则随传代逐渐增加。结论：CSPCs从组织到培养过程中,其生长特征,表面标志和功能表型是一个动态变化过程。第三章软骨干/祖细胞生长分化的病理生理因素调控研究目的：根据CSPCs定义中的迁移特性,研究骨关节炎中一些常见病理生理因素如炎症因子和细胞外间质成分改变对CSPCs行为的调控。方法与结果：该部分实验在体外检测CSPCs在炎性病理相关条件下细胞行为和功能基因的变化。主要研究：1)炎症因素对于CSPC的影响；2)NGF对于CSPCs的影响；3)三维微环境对CSPCs成软骨能力的影响。我们发现,1)在炎症因子IL-1α的存在条件下,CSPCs自身的IL-1β基因显著上调；炎症因子IL-1β能够增强CSPCs的NGF的表达；NGF的刺激在基因水平引发了基质基因Agn的表达降低,基质降解酶MMP13的表达升高。2)利用Transwell模型发现：在NGF的刺激下,CSPCs的迁移能力有了显著增强。利用干细胞体外成软骨的Pellet模型发现：NGF, NGF受体抗体,NGF受体抑制剂都能不同程度降低CSPCs的成软骨能力,而NGF抗体则对于CSPCs成软骨能力有所提升,具体表现在细胞核形态和基质沉积方面。3)利用脱细胞基质(ECM)构建三维成软骨模型我们发现,CSPCs受不同来源的基质影响较大。CSPCs在透明软骨来源的ECM上表现出更高的软骨基质基因,在半月板来源的ECM上则一型胶原基因升高。结论：这项研究阐明了炎性因子对于CSPCs迁移特性的影响,首先发现了NGF促CSPCs迁移作用。同时加速软骨基质降解,利用NGF抗体部分逆转NGF对CSPCs成软骨能力的抑制作用。NGF抗体先前报道的能够抑制关节炎疼痛但机制不明,本研究发现其能够有效提升CSPCs均成软骨能力,从软骨的组织干细胞---CSPCs这一新角度显示了NGF抗体对骨关节炎的治疗潜能,为骨关节炎治疗提供新思路和新证据。第四章软骨干/祖细胞与BMP4再生软骨研究目的：利用软骨干/祖细胞构建组织工程化软骨,并优化其生长因子及构建方案。方法与结果：本研究首先在体外对BMP家族中的有报道的具有促进软骨分化能力的生长因子BMP2,BMP4和BMP7进行了检测,基因水平显示BMP4促进软骨干/祖细胞的二型胶原表达高于其他组；体外构建的组织工程化软骨,BMP4刺激组体积显著大于对照组；组织学表明,BMP4刺激下的CSPCs软骨基质增多明显。在兔膝关节软骨缺损模型中,BMP4显著促进其软骨缺损再生和力学性能增强。结论：利用软骨干/祖细胞能够构建软骨组织,软骨干/祖细胞能够作为软骨组织工程的种子细胞。生长因子BMP4能够促进CSPCs软骨基质生成,在兔膝关节模型上能促进软骨修复效率。第五章自体软骨祖细胞的临床应用研究目的：使用自体软骨祖细胞移植治疗大面积的膝关节软骨缺损。方法与结果：对于大面积的膝关节软骨缺损(6-12cm2)的患者5例,关节镜下获取200mg左右关节非负重区软骨组织,然后采用低密度克隆形成技术扩增软骨祖细胞至1×107数以上,随后进行种子细胞的安全性和功能性检测,以及体外复合三维支架,2-3周内进行第二次小切口移植手术。整个过程按照卫生部《组织工程化组织移植技术》三类医疗新技术管理规范,在获批临床准入的浙江大学附属医院骨科开展。术后立即进行被动屈伸等功能康复锻炼,6周内部分负重,12周全负重,随访时间超过2年,Lysholm、IKDC评分显著增加,关节活动度和疼痛感明显改善,可自由参加体育活动。结论：研究结果显示自体软骨祖细胞具有可以快速扩增用于临床修复大面积关节软骨缺损的潜能。