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棉花作为主要的纺织工业原料,是最重要的经济作物。棉花黄萎病作为一种维管束病害,每年对棉花生产造成的损失巨大。我们对黄萎病菌(Verticilliumdahliae)致病的分子机理了解的并不多。历史上对黄萎病致病机理存在两种看起来相互冲突的观点:一种认为黄萎病是由于真菌分泌的毒素导致的,另一种则认为黄萎病菌导致的维管束堵塞才是导致病害的原因。
为了深入了解棉花与黄萎病菌相互作用的分子机制,本论文利用蛋白质组学及表达谱学来探讨棉花在黄萎病菌侵染早期的变化。在建立有效接菌体系及蛋白质组学方法分析基础上,对强致病型V.dahliae侵染早期的棉花差异蛋白质组学进行了研究。而V.dahliae按照致病类型可以分为强中弱三种,为了解释弱致病型V.Dahliae侵染后,棉花无病理症状的原因,使用Solexa测序表达谱学技术分析了棉花根部的差异表达基因。
1.适于棉花幼苗蛋白质组研究的总蛋白质提取方法的建立
为了找到一种适合棉花幼苗的蛋白质提取方法,对四种常用的植物蛋白质提取方法进行比较。结果表明:三氯乙酸-丙酮及酚提取法(Method D)提取的蛋白最优,在双向电泳(2D)凝胶上的蛋白点也最多(321);丙酮-酚提取法(MethodB)提取的蛋白在2D凝胶上显示出216个蛋白点;三氯乙酸-丙酮(Method A)提取法则不适于棉花的蛋白质提取,仅仅有少许的低分子量蛋白出现在2D凝胶上;酚提取法(Method C)提取的蛋白在2D凝胶上显示出240个点,但其凝胶背景较高。因此我们选择Method D,并对其进行了优化。利用优化的Method D提取的棉花总蛋白,通过双向电泳后,用考马斯亮蓝G-250染色在2D凝胶上可见900多个蛋白点,蛋白点数比优化前增加了约3倍。以上结果表明优化后的Method D更加适合棉花幼苗的蛋白质组学研究。
优化的Method D方法为:首先使用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白质,去除色素等有机物质。然后进行洗涤,使用酚抽两次提蛋白样品减少蛋白损失,接着使用提取液抽提酚相去除可能的水溶性物质。最后使用醋酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质,并使用甲醇与80％丙酮分别洗涤两次。
用优化的Method D提取V.dahliae侵染前后的棉花叶片总蛋白,然后进行差异蛋白质组分析。其中一个差异蛋白点Flavanone3-hydroxylase(F3H)表现出明显的上调表达,进一步的实验证明伤处理棉花后F3H下游与Proanthocyanidins(Pas)合成相关的基因多表现为协同性的上调表达。这些结果表明Pas可能在V.dahliae侵染与伤诱导的棉花中扮演重要作用。然而实验也表明V.dahliae侵染后,棉花叶片差异蛋白较少。棉花根部可能是更好的V.dahliae与棉花互作研究材料,因为V.dahliae侵染是从根部开始。
2.V.dahliae侵染早期,棉花根组织的差异蛋白组学研究
在优化的Method D基础上,建立了一个适合棉花根部蛋白组提取方法。V.dahliae侵染棉花后棉花根部组织材料在0 h,24 h与72 h分别被收集,并提取蛋白质进行双向电泳,平均有830±11蛋白点在凝胶上被检测到。进一步通过质谱鉴定了34个差异表达蛋白的肽指纹图谱(Peptide-mass fingerprinting,PMF)。因为缺乏棉花的基因组序列,我们在数据鉴定时以高等植物的数据库为比对数据库。有15个蛋白点被鉴定,其中1个上调表达,10个下调表达,4个表现为临时上调表达。按照功能分,这些蛋白包括病原相关蛋白、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)调节蛋白、折叠与修饰相关蛋白、糖与能量代谢相关蛋白及一些其它蛋白。
总的来看,棉花受V.dahliae侵染后,首先建立早期的防御反应(如PR蛋白及ROS)。然而这并不足以有效保护棉花,V.dahliae可能通过抑制或者破坏防御相关基因的表达从而成功侵入棉花,棉花的正常生理功能很快被破坏,一些蛋白表现为明显的下调(如糖与能量代谢相关蛋白,折叠与修饰相关蛋白及细胞骨架蛋白)。
3.与活性氧及细胞死亡相关的毒素抑制试验
前述蛋白质研究表明棉花受V.dahliae侵染后,早期的一个防御反应与ROS相关,在此通过植物组织染色进一步证实了V.dahliae的侵染导致棉花微管组织内的ROS及细胞死亡。进一步的实验还表明V.dahliae的上清液单独就能导致叶片的萎焉坏死。
为了验证V.dahliae毒素诱导的细胞死亡是否是通过主动调控植物而造成的,我们通过蛋白合成抑制剂(Cycloheximide,CHX)注射烟草叶片,实验表明CHX能有效延迟毒素导致的叶片坏死斑形成。然而ROS抑制剂(Diphenyleneiodoniumchloride,DPI)及蛋白酶体抑制剂(Z-Leu-Leu-Leu-al,MG132)并不能阻止毒素导致的叶片坏死。这些结果告诉我们V.dahliae毒素是通过积极调控宿主蛋白质的合成来诱导植物细胞死亡的,但这些调控并不是已经研究发现的活性氧突发或者泛素/26S蛋白酶体途径(ubiquitin/26S proteasome system)。
此外,V.dahliae毒素能在老叶片上快速导致细胞坏死,而在嫩叶片上则不能,这表明V.dahliae毒素导致的细胞坏死也与叶片的年龄有关。这与V.dahliae导致的叶片萎焉坏死症状是从植株底部的老叶片开始往顶端嫩叶片扩展的病理症状是一致的。
4.弱致病V.dahliae侵染棉花后,棉花根部组织的表达谱分析
弱致病V.Dahliae菌株侵染棉花后,并不能导致棉花产生明显的病理症状,然而通过PCR能够检测到V.dahliae已经进入棉花幼苗的根与茎中。在表达谱分析前,基于Solexa测序技术对RNA样本质量的要求,而实验室已有的实验方法提取的棉花根部组织RNA并不能满足要求,因此通过比较几种提取方法,我们选择并优化了一种质量可靠的棉花根部组织RNA提取方法。
提取V.dahliae侵染72 h后棉花根部组织的RNA样品,通过Solexa测序,以对照组(Control)样品得到的基因表达丰度信息为对照,分析实验组(Treatment)样品基因的相对表达丰度,共有2681个表达上调或下调的差异基因,其中包含1017个上调表达基因与1664个下调表达基因。
对差异表达基因进行KEGG Pathway显著性富集分析后发现。这些差异表达基因包含在4条上调表达通路与3条下调表达通路中。这些上调表达通路包括:1),黄酮(Flavone)与黄酮醇(Flavonol)代谢通路;2),类黄酮类物质(Flavonoid)代谢通路;3),外芪类化合物(Stilbenoid),二芳基庚醇(Diarylheptanoid)及姜辣素(Cringerol)合成代谢途径,这几条通路的产物已经被证明具有抗氧化、抗微生物的性质;4),细胞色素P450单加氧酶外源物质代谢(Metabolism of xenobiotics)通路,该通路参与代谢细胞外有毒物质。下调表达通路包括:1),核糖体(Ribosome)相关通路;2),剪切体(Spliceosome)相关通路,Spliceosome与Ribosome分别参与基因的表达与蛋白翻译过程,这两个通路相关基因的下调表达表明,在V.dahliae的侵染下,植物本身的正常生理功能可能已被破坏,这个结论与棉花被弱致病菌侵染后表现的症状一致(棉花侧根严重坏死);3),甾族化合物(Steroid)代谢通路,该通路代谢产物能促进植物组织分化及生长,然而Steroid通路与病原菌互作的相关报道很少,因此我们使用Realtime-PCR验证该通路中一些基因的表达变化,结果显示大多数Steroid通路基因表现为临时下调,然后明显上调表达。这个表达变化过程对应棉花根在V.dahliae侵染后的变化(棉花侧根在V.dahliae侵染早期快速坏死,后主根基部又长出一些新侧根)。一个可能的解释是Steroid通路代谢产物促进棉花新根的生长,这对棉花被V.dahliae侵染后的生存至关重要。