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实验用鱼是一类重要的实验动物,其中斑马鱼(Danio rerio)和有“环境监测器”之称的剑尾鱼(Xiphophorus helleri)在生命科学的诸多领域发挥着不可或缺的作用。虽然这些实验用鱼的功能学研究开展较早,但涉及遗传质量控制基础的遗传监测研究较为少见。建立相应的遗传检测方法,对其进行遗传质量控制,保证实验用鱼质量稳定、结果可靠,是亟待解决的问题。 本课题应用生化标记和DNA分子标记技术,通过乙酸纤维素薄膜的同工酶电泳、RAPD随机扩增、STR扩增的方法,尝试从蛋白水平和核酸水平建立实验用鱼的遗传检测方法。以封闭群斑马鱼(AB、LF、本地短尾(short tail,ST)各20尾)和近交系剑尾鱼(RR-B、RW-H、BY-F各6尾)为实验材料进行研究。同时以近交系剑尾鱼为标准,用6尾非选育剑尾鱼进行了方法的重复性验证。 经过研究,在蛋白水平上,斑马鱼肌肉来源同工酶在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Gpd)、过氧化氢酶(Ce)、苹果酸脱氢酶(Mod)、葡萄糖磷酸异构酶(Gpi)、酯酶(ES)这5个生化位点在三种群中均表现出多态性。经卡方检验分析,Gpd、Gpi位点群间差异显著(P<0.01),Ce、Mod有群间差异(P<0.05)。对近交系剑尾鱼进行了眼睛、肝脏、肌肉的组织特异性研究,发现大部分酶在肝脏中活性较强。选用代表组织进行分析,同一生化位点在各品系内表现较为一致。在Gpi、Gpd位点RR-B系表现出特异性条带,RW-H系在Ce位点表现出特异性条带。非选育剑尾鱼在Gpi、Gpd、Ce位点表现出多态性。 在DNA水平上,经过优化PCR反应条件,扩增筛选了RAPD引物。在斑马鱼和剑尾鱼中,分别得到5条和11条稳定性较好的对随机引物。图谱直观分析,斑马鱼AB群在SJD3的随机扩增产物主带集中在700bp~900bp之间,而ST、LF群的扩增产物2条主带均在1000bp以上。剑尾鱼RR-B系在P30和S97扩增产物中表现出特异条带。RR-B系 P30扩增产物存在约1500bp的特异主带,在S97的扩增产物存在300bp至400bp之间的一条特异主带,可直接判读与其他品系的差异。按照Neis原理与生物多样性分析方法,利用Popgen32软件分析得到Shannons指数Nei基因多样性指数(h)均有AB>LF>ST。两两比较分析遗传距离(D)得出 DST&LF<0.20.05)。在剑尾鱼中,引物AY204223的扩增条带表现出多态性,在RR-B与BY-F系表型一致,且与RW-H表型不同。在该微卫星克隆位点,非选育剑尾鱼亦表现出多态性条带。 本研究还对两种实验用鱼中丽春红染色一种蛋白标记进行初步探讨。该蛋白在封闭群斑马鱼群间表现无差异,在近交系剑尾鱼中,仅RR-B系表现出特异谱带,非选育剑尾鱼表现多态性谱带。对该蛋白的从属定性还有待更深入研究。 综上,建立的生化标记具有较好重复性,操作简便,结果易判读,可作为斑马鱼和剑尾鱼的遗传生化标记方法;利用随机引物和微卫星引物从基因水平初步建立了斑马鱼、剑尾鱼的RAPD和STR群体遗传分析方法,为建立实验用鱼的遗传检测技术打下了基础,对实验用鱼的遗传质量控制具有重要意义。