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目的:血管钙化是慢性肾脏病(CKD)患者的常见并发症,与心血管疾病(CVD)死亡率密切相关。众所周知除传统危险因素,非传统因素,如尿毒症毒素、矿物质代谢紊乱,尤其是高磷血症,在血管钙化的发生发展中起着重要的作用。其中高磷可通过很多途径诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)发生钙化,如血管平滑肌细胞凋亡、骨源性分化、钙化促进因子(如:核心结合因子α-1)及抑制因子(如:基质G蛋白;骨桥蛋白质)的平衡紊乱等。因此由于血管钙化发生的机制十分复杂,致使目前对血管钙化尚无有效的预防和治疗方法。镁离子作为体内重要的阳离子对维持血管弹性和心脏节律有重要的作用,因此近年来镁离子与血管钙化之间的关系备受关注,有临床研究发现碳酸镁可能会抑制冠状动脉钙化的进展,但镁离子和血管钙化之间的确切关系目前尚不完全明确,因此本研究旨在探讨增加镁离子浓度后对高磷诱导血管钙化的影响及其可能的机制。方法:1 VSMCs原代培养取5周龄雄性健康SD大鼠胸主动脉通过组织贴壁法进行VSMCs原代培养,应用形态学和免疫学方法进行平滑肌细胞鉴定。2实验干预及分组随机将VSMCs分为4组:(1)正常对照组:加入10%胎牛血清的低糖DMEM培养基;(2)高磷组:正常培基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸(β-GP);(3)镁干预组:在高磷培基中加入3 mmol/L硫酸镁(Mg SO4);(4)镁通道抑制剂(2-APB)干预组:高磷培基中加入3 mmol/L Mg SO4及10-4 mol/L 2-APB。各组VSMCs分别培养0、3、6、10、14天。3在培养14天后测定各组VSMCs的钙化水平各组VSMCs的钙化染色应用茜素红(Alizarin red stain)方法;各组VSMCs钙含量测定应用邻甲酚酞络合酮比色法。4在培养14天后测定各组VSMCs的碱性磷酸酶(ALP)活性将各组VSMCs培养14天后弃去其上清液,依据ALP活性试剂盒测定ALP活性,此过程严格按照试剂盒说明书进行操作。5在不同时间点测定各组VSMCs核心结合因子α-1(Cbfα1)m RNA的表达应用逆转录PCR分别检测0天、3天、6天、10天、14天时正常对照组、高磷组、镁干预组以及14天时镁通道抑制剂干预组Cbfα1 m RNA的表达。6在不同时间点分别检测各组VSMCs中基质G蛋白(MGP)m RNA和骨桥蛋白质(OPN)m RNA的表达。应用RT-PCR分别检测0天、3天、6天、10天、14天时正常对照组、高磷组、镁干预组以及14天时镁通道抑制剂干预组VSMCs MGP m RNA和OPN m RNA的表达。7统计学处理应用SPSS19.0软件进行数据统计学分析,实验数据应用均数±标准差表示,多组间均数差异比较应用单因素方差分析(ANOVA),组间均数两两比较应用SNK检验,P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1大鼠VSMCs的原代培养大鼠原代VSMCs采用组织块贴壁法获得,一般情况下动脉组织块贴壁后约3~4天即可爬出少量细胞,细胞形状主要为长梭形,并以束状形式排列,组织块贴壁6-7天后细胞融合成片,细胞形状仍以梭形为主。当细胞处于亚融合状态时即可传代,传代后的细胞开始为椭圆形或者圆形,待细胞贴壁后可逐渐伸展为梭形,细胞浆丰富,细胞核呈圆形或者卵圆形,细胞重叠生长,呈现出“峰-谷”样。α-平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA actin)是血管平滑肌细胞特异性抗体,免疫学方法检测的阳性结果为平滑肌细胞胞浆内强表达α-SMA actin,胞浆内呈现棕黄色。2高镁抑制高磷诱导的VSMCs钙化及ALP活性各组VSMCs钙化染色结果:与正常对照组相比,高磷组可见大量橘红色钙盐沉积;与高磷组相比,镁干预组细胞钙盐沉积明显减轻,镁通道抑制剂干预组钙盐沉积比镁干预组明显增加。与钙化染色相一致,钙含量测定结果显示镁干预组明显降低高磷诱导的钙盐沉积(P<0.05),而这种作用可被2-APB抑制(P<0.05)。ALP活性测定结果显示:镁干预组ALP活性明显低于高磷组及镁通道抑制剂干预组(P<0.05)。3高镁抑制高磷诱导的VSMCs中骨源性因子Cbfα1的表达,并呈时间依赖性RT-PCR结果显示,培养14天后,镁干预组Cbfα1的水平明显低于高磷组及镁通道抑制剂干预组(P<0.05)。且动态观察Cbfα1的表达变化发现在培养第3天时,高磷组Cbfα1表达即明显增加(P<0.05),并随着时间的延长呈上升趋势;而高镁在第3天时即明显抑制了Cbfα1表达,长期培养过程中其抑制效果逐渐增强。4高镁可上调钙化相关抑制因子MGP和OPN的表达,并呈时间依赖性RT-PCR结果显示,培养14天后,镁干预组MGP m RNA和OPN m RNA的表达水平高于高磷组及镁通道抑制剂干预组(P<0.05)。动态观察MGP m RNA和OPN m RNA的表达变化,结果显示在培养第3天时,高磷组MGP m RNA和OPN m RNA表达水平均降低(P<0.05),并随着时间的延长呈下降趋势;在培养第3天时,高镁抑制了高磷诱导的MGP m RNA和OPN m RNA表达下降的作用(P<0.05),且长期(14天)暴露在高镁环境中可逐渐增加MGP和OPN的表达。结论:1高浓度镁离子可抑制高磷诱导的VSMCs钙化。2高浓度镁离子抑制VSMCs钙化的机制可能是通过降低Cbfα1的表达抑制VSMCs表型转化,并上调内源性钙化相关拮抗因子MGP及OPN的表达来实现的,且此过程呈一定的时间依赖性。