以食源性致病菌和真菌毒素为代表的食品生物性危害是威胁我国食品卫生和安全的重要因素,然而由于食品种类的多样性、成分的复杂性以及生产运输的时效性使实现快速精准定量检测成为目前食品生物性危害控制的研究难点。目前,细菌培养和液相-质谱联用作为食品检测的“金标准”存在着时效性差、操作繁琐和成本高等缺点,难以满足食品监管部门快速检测的要求。基于微机电系统（Micro-Electro-Mechanical System,MEMS）技术制造的微流控系统由于其微型化、集成化和自动化等优点,在快速检测领域受到了广泛的关注。此外,微流控芯片的封闭结构和自动化工艺有效降低了人工操作造成污染的风险。目前,通过将生物分子检测方法集成于微流控芯片来开发小型化且成本效益高的快速分析平台是应对全球食品安全挑战的有效手段。根据食品安全的实际需求,本文将微流控技术、特异性分子识别元件、新型分子生物学检测方法与纳米材料的信号转导机制有机结合,建立一系列高灵敏度、高通量、高稳定性的食源性致病因子微流控检测平台,形成对食品常见生物性危害控制和精准溯源系统。主要研究内容如下:1、为了建立针对单一食源性病原菌高精准检测的通用性方案,本文开发了一种基于泛基因组分析和数字核酸检测技术的高保真目标微流控识别（high-fidelity target microfluidic identification,HFTMI）策略,并以副溶血性弧菌为模型进行了验证研究。首先,通过泛基因组分析方法对由NCBI公共数据库中872株副溶血性弧菌和743株非副溶血性弧菌基因组序列组成的本地数据库进行分析,鉴定出23个特异的副溶血性弧菌分子靶点,并筛选出具有较高灵敏度和广谱性的group＿41170作为副溶血性弧菌高保真靶标。并通过研究不同动力系统提高实时荧光重组酶辅助扩增（quantitative recombinase-aided amplification,q RAA）反应体系在基于腔室的数字化微流控芯片上的分区效率。相比于q PCR,HFTMI策略在检测实际样品时展现出更高的灵敏度和耐受性,对人工污染样品的最低可定量浓度为10~2 CFU·m L-1。此外,HFTMI具有操作简单、设备复杂程度低、比商用液滴数字PCR时间成本低、对各类样品检测能力强等优点。HFTMI策略可为不同病原体的绝对定量检测方法的开发提供有力支持,为食品微生物安全检测提供更可靠的指导。2、为了满足食品安全监管中对多种病原微生物同时检测的实际需求,本文开发了一种基于实时荧光的高通量离心式微流控芯片以克服数字化芯片在通量上的限制。为了实现对食品中常见沙门氏菌血清群的精准快速溯源,基于团队已挖掘的沙门氏菌血清群特异性分子靶标和q RAA开发出SSG-RAA HTM高通量微流控系统以实现同时检测沙门菌属和5个血清群（B、C1、C2-C3、D、E）。与传统的玻片凝集法相比,SSG-RAA HTM系统在检测时间（15～40 min）和结果判读的可靠性方面具有明显优势。该系统的最低检出限为10~1 CFU·m L-1（属和血清群B、C1、C2-C3）或10~2 CFU·m L-1（血清群D、E）。该系统在实际样品验证中具有良好的稳定性（C.V.s＜5%）和准确性（＞98%）。3、基于上述离心式微流控平台,以团队前期挖掘的11种沙门氏菌血清型的特异性靶标为分子识别元件,在芯片上建立相应的可编程环介导等温扩增体系（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP-chip）,实现对中国零售食品中常见沙门氏菌血清型的快速精准鉴定。以金纳米粒子（Au nanoparticles,Au NPs）作为单链DNA引物和聚合酶的载体开发的可编程LAMP可有效抑制错配和低温假退火带来的假阳性,并在芯片上表现出良好的稳定性和抗干扰能力。基于可编程LAMP的基因血清分型策略可在40 min内完成整个检测过程,其检出限为10~2或10~3 CFU·m L-1。参照标准培养和鉴定方法,该策略对688株沙门氏菌和22株非沙门氏菌的检测准确率为100%。LAMP-chip在对实际样品的检测中表现出良好的回收率,其精密度为85.9%～105.2%,RSD＜10%。相比于只能进行单一血清型鉴定的玻片凝集法,该方法可以实现对食品中存在的多种沙门氏菌血清型的同时检出。此外,该基因血清分型策略可以根据最流行的血清型的趋势,对芯片上的检测模块进行修改,以满足食品部门对沙门氏菌监测的最新需求。4、为了实现快速、灵敏地检测小分子真菌毒素,开发了一种基于“量子点”双信号模式的聚二甲基硅氧烷重力驱动循环微流控芯片通过模块化设计实现常规竞争免疫测定法（Competitive immunometric assay,CIMA）操作流程自动化并用于黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）的检测。该策略通过芯片的结构设计和以双波长量子点的荧光比值作为信号输出模式,有效地消除了环境因素的影响,提高了信号的稳定性,并确保最终检测结果与目标浓度呈正相关性。此外,对建立的芯片内部三维反应界面物理模型进行理论分析,证实了该微流控策略提高了免疫吸附反应速率。该方法呈现出宽的分析范围(0.2～500 ng·m L-1),低检出限(0.06 ng·m L-1),高特异性,高精确度（C.V.s＜5%）,良好的重复性（20次,89.1%）。在实际样品应用中,该CIMA芯片在对三种食品样品中的AFB1检测中均获得了良好的回收率,展现了较好的实际样品分析能力。此外,该芯片的可重用性和可设计性为AFB1的现场检测、并可将其应用于多种生物毒素和食源性病原菌的多元可视化检测和实现低丰度靶标的快速定量检测。5、为了实现食品中常见真菌毒素的高通量超敏检测,本文基于六种真菌毒素的识别序列构建了基于CRISPR系统的一体化小分子检测方法,并通过量子点和光子晶体的信号转导和增强机制建立一种便携式的高通量微流控超敏检测平台（functional DNA-guided microfluidic biosensors,FMB系统）实现对六种食品中危害较大的真菌毒素精准检测。该方法采用具有特异性识别功能的DNA序列构建包含激活子的触发开关并通过Mfold进行二级结构模拟,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和实时荧光曲线分析触发开关的可行性。构建CRISPR系统的通用量子点探针和具有与之匹配光子带隙的光子晶体薄膜实现输出信号显著增强至45.6倍。通过调整cr RNA和激活子序列组成比例构建过渡态CRISPR系统实现对低浓度目标真菌毒素的高响应。结果表明:FMB系统中各个检测单元具有良好的特异性,其检测限可以达到fg·m L-1。采用冻干工艺包埋CRISPR相关试剂的FBM系统仍然具有超灵敏的分析性能和良好的稳定性。采用实际样本评估FMB系统的实用性,所有结果都与高效液相色谱法保持高度一致（88.76%～109.99%）。综上所述,本论文开发了一系列微流控检测平台用于实现食源性致病因子的高通量和超敏检测。针对于食源性病原菌,通过以副溶血性弧菌为研究模型,构建了高保真目标微流控识别策略实现对病原菌的绝对定量检测。此外,基于已挖掘的沙门氏菌血清群和血清型分子靶标,分别采用q RAA和可编程LAMP在离心式微流控芯片上建立高通量基因血清分型系统,实现对同一样品中多靶标识别,进一步提高了沙门氏菌筛查结果的可靠性和准确性。针对于食源性生物毒素,建立了具有双信号模式策略的集成化重力驱动CIMA芯片用于便携式检测单一毒素AFB1,和基于功能性DNA调节和过渡态CRISPR系统的超敏微流控生物传感器来实现真菌毒素高通量检测。这些策略通过对微流控芯片的高效理性设计实现分子检测方法高度集成化,为开发高通量超敏微流控分析系统在食源性致病因子的风险识别、溯源追踪以及快速检测提供理论和技术支撑。