【摘 要】
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该室构建了pcDNA3.1-Aβ、pcDNA3.1-A β真核表达质粒,为进一步研究Aβ主动免疫清除老年斑的作用机理和DNA疫苗的研制奠定基础.一、Tg2576转基因鼠基因组DNA的提取和目的基因
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该室构建了pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-A β<,42×2>真核表达质粒,为进一步研究Aβ<,42>主动免疫清除老年斑的作用机理和DNA疫苗的研制奠定基础.一、Tg2576转基因鼠基因组DNA的提取和目的基因扩增.饱和酚/氯仿法鼠尾提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,根据其基因序列,设计出扩增编码Aβ基因的引物,以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因片段Aβ<,1-42>、Aβ<,42-1>、Aβ<,42-2>.二、真核表达载体pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>的构建及鉴定.将目的基因片段Aβ<,1-42>纯化后与质粒pcDNA3.1分别用限制性内切酶Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ酶切、纯化后用T<,4>DNA连接酶将目的基因片段定向克隆至质粒pcDNA3.1的多克隆位点间,得到重组质粒pcDNA3.1-A β<,1-42>,将目的基因片段Aβ<,42-1>纯化后与质粒pcDNA3.1分别用两种限制性内切酶Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ酶切、纯化后用T<,4>DNA连接酶将目的基因片段Aβ<,42-1>定向克隆至质粒pcDNA3.1的多克隆位点间.三、peDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-A β<,42×2>的真核表达.无菌提取质粒pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>,用lipofectamine2000转染COS-7细胞,对其表达的蛋白进行Western Blotting鉴定,并对细胞进行免疫组化染色,证实其能在真核细胞中表达出目的蛋白.综上所述,该研究成功地扩增了目的基因片段Aβ<,1-42>、Aβ<,42-1>、Aβ<,42-2>,并将Aβ<,1-42>、Aβ<,42×2>基因分别克隆到真核表达载体上,成功地构建单价及二价真核表达载体pcDNA3.1-Aβ<,1-42>、pcDNA3.1-Aβ<,42×2>.将构建的真核表达载体转染COS-7细胞,证实了其可在真核细胞中表达,为我们下一步将其应用于转基因鼠奠定了基础.
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