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柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑橘衰退病是世界性的柑橘病毒病害,分布于世界各主要柑橘产区;作为柑橘产量大国,柑橘是我国南方农村经济的重要支撑。然而我国广泛分布 CTV最有效传毒媒介—褐色橘蚜(Toxoptera citricida,Kirkaldy),加之柚类、甜橙品种增多的产业结构调整,使CTV对我国柑橘产区的危害日趋严峻。柑橘衰退病自发现以来已近一个世纪,各科研工作者对CTV进行了大量研究,以期为CTV的防治提供依据;但迄今为止,CTV的蚜传机制仍不明确。 昆虫媒介传播半持久性植物病毒包括获毒、传毒两个阶段;迄今为止,关于褐色橘蚜传毒特性研究主要集中于褐色橘蚜获毒过程对其传毒率的影响,例如:蚜虫获毒量及CTV毒源含毒量、蚜虫发育虫态及虫口密度、蚜虫获毒时间、CTV毒源株系和CTV毒源品种等因素对传毒率的影响;对传毒过程的研究仅限于受毒植株品种。并且,关于蚜虫获毒量、CTV毒源含毒量对CTV蚜传率的影响主要是从基因方面入手。对于蚜虫获毒后,传毒过程中其体内CTV含量与传毒率的关系尚无报道。 本研究基于前人研究结果,对褐色橘蚜EF-1α、EF-2、RAPAO、RPL5和Actin五个内参基因稳定性进行评价,并利用实时荧光相对定量 RT-qPCR方法,基于CT11、CT14、CT16-2和CT立间四种不同蚜传率CTV分离株研究获毒褐色橘蚜在健康植株上传毒不同时间所携带 CTV的含量,并分析了携毒橘蚜中 CTV含量与在健康植株上取食时间的关系和与传毒率的关系;利用western blot技术从蛋白层面分析植物蛋白含量对蚜传率的影响;以期为揭开蚜虫传播CTV机制奠定基础。 主要研究成果: 1.利用Genorm、Normfinder和Bestkeeper三个内参分析软件评价了在不同CTV毒源影响下,褐色橘蚜EF-1α、EF-2、RAPAO、RPL5和Actin五个内参基因的表达稳定性;用Genorm和Normfinder分析时稳定性顺序为RAPAO>EF-1α>EF-2> Actin> RPL5,用Bestkeeper分析时稳定性顺序为RAPAO> EF-1α>EF-2>RPL5>Actin,结合Genorm软件基因标准化因子配对差异分析Vn/(n+1)<0.15筛选出在该条件下最好用EF-1α和RAPAO进行多内参校正; 2.获毒CT11、CT14毒源的携毒褐色橘蚜中 CTV相对表达量在带毒橘蚜取食健康植株0.5 h就显著降低,0~3 h内降低较快,3~9 h时间段内无显著变化,相对表达量在0.10~0.18范围内,12~48 h时间段内无显著变化,相对表达量在0.03~0.07范围内; 3.获毒CT16-2毒源的携毒褐色橘蚜中CTV相对表达量在带毒橘蚜取食健康植株9 h内均无显著变化,相对表达量在0.12~0.18范围内,12 h时显著降低,相对表达量为0.06,12~48 h时间段内无明显差异,相对表达量在0.01~0.06范围内; 4.获毒CT立间毒源的携毒褐色橘蚜中CTV相对表达量在带毒橘蚜取食健康植株0.5 h显著降低;取食3~6 h时间段内,褐色橘蚜中CTV含量无显著性差异,相对表达量在0.10~0.14范围内,之后显著降低;9~24 h时间段内无显著性差异,相对表达量在0.05~0.07范围内; 5.利用SDS-PAGE比较尿素提取法、TCA-酚沉淀法、PBS法和TCA-丙酮沉淀法四种快速蛋白提取法提取甜橙和葡萄柚两种柑橘品种的提取效果;PBS法和TCA丙酮法提取效率较低,TCA-酚和尿素提取法提取效率较高,但TCA-酚背景较低,小分子条带更多,条带更清晰; 6. CTV p20、p23和p25三种CTV毒源蛋白相对表达量在CT11、CT14、CT16-2和CT立间四种毒源的嫩叶和嫩皮中相似,并与CTV株系蚜虫传毒率呈正相关;推测此三种蛋白可能与蚜虫传毒有关。 7. p27蛋白在CT11、CT14、CT16-2和CT立间四种CTV毒源嫩叶中相对表达量高低顺序也与传毒率高低顺序趋势基本一致。