猪因其呼吸道上皮同时具有人（α-2,6）和禽（α-2,3）流感病毒受体,被认为是人和禽流感病毒间发生基因重配的重要场所。有研究表明,我国近10年来猪群中广泛流行的猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）为欧亚类禽H1N1（Eurasian avian-like H1N1,EAH1N1）、2009 大流行 H1N1（Pandemic 2009 H1N1,Pdm09H1N1）以及类人 H3N2（Human-like H3N2,HLH3N2）。并且,这三种不同进化谱系的SIV持续不断地在猪群中发生着基因片段的重组,产生了众多基因型。值得注意的是,刘金华等学者报道的基因4型（Genotype4,G4）EAH1N1不仅在猪群中获得了优势流行,还具有较强的跨宿主传播潜能,对养猪业和公共卫生安全均构成了严重威胁。本研究基于目前我国猪群中主要存在H1和H3亚型SIV的现状,建立了同时检测并区分两种亚型SIV的一步法双重荧光定量RT-PCR（Real-time reverse-transcriptive PCR,RT-qPCR）方法,并将其应用于 SIV 的流行病学调查与分离鉴定,且进一步对临床分离株的遗传进化与生物学特性进行了分析。研究结果将为SIV的快速检测提供技术支撑,并为深入了解SIV的流行动态及致病特性提供理论参考。1.H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用本章通过比对近10年在我国流行的SIV HA基因序列,设计了一对能够同时匹配EA H1N1和Pdm09 H1N1的引物探针组以及一对匹配HL H3N2的引物探针组,并在此基础上建立了一种基于TaqMan-MGB探针的一步法RT-qPCR方法。该方法具有良好的灵敏性,最低能够检测到5copie/μL的质粒标准品以及2.1 EID50/mL的病毒RNA。此外,通过同时使用RT-qPCR和鸡胚接种对人工感染SIV的小鼠肺脏进行检测,RT-qPCR方法与传统的病毒分离法具有97.9%（47/48）的符合率。并且,该双重RT-qPCR在进行批间和批内重复性试验时,变异系数（Coefficientofvariation,CV）均小于3%,提示其具有良好的重复性。进一步地,应用该RT-qPCR方法对2019-2020年秋冬季屠宰场来源的猪鼻拭样品进行检测,结果显示H1亚型SIV的阳性数总体要高于H3亚型,此结果与其他研究人员所报道的情况一致,表明该RT-qPCR方法在H1和H3亚型SIV的快速检测方面具有较好的应用前景。2.猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析结合第一章中建立的RT-qPCR检测方法,从屠宰场所采集的598份鼻拭中成功分离出具有血凝活性的9株EAH1N1和4株HLH3N2病毒,并另从170份由猪场送检样品中分离获得1株EA H1N1病毒。接下来,基于这14株病毒的HA基因的测序结果,选取出其中的3株EAH1N1和2株HLH3N2亚型SIV进行全基因组测序与遗传进化分析。结果显示,这5株SIV均具有Pdm09 H1N1的PB2、PB1、PA、NP 和 M 基因以及三源重组（Triple reassortant,TR）SIV 的 NS基因,即它们的内部基因组成来源均与当前中国猪群中优势流行的G4 EAH1N1相 同。此 外,值 得注 意 的 是,EA H1N1 分 离 株A/swine/Huadong/11/2020（H 1N1）[HD 11]与 人 流 感 病 毒 株A/Shandong/00204/2021（H1N1）高度同源,两者的核苷酸一致性高达99.35%～99.89%,提示这两株H1N1可能具有共同祖先或两者间存在跨宿主传播。3.5株猪流感病毒的生物学特性研究进一步对第二章中已全基因测序的5株SIV进行了抗原差异性分析与受体结合能力、体外复制能力和对小鼠致病能力的测定。结果显示,3株G4 EAH1N1分离株之间及其与基因1型（Genotype 1,G1）、基因5型（Genotype 5,G5）之间和2株HL H3N2分离株之间及其与人源H3N2病毒间均不存在明显的抗原性变化,但部分EA H1N1毒株与Pdm09 H1N1存在一定的抗原性差异;5株SIV均呈现α-2,3和α-2,6双受体结合特性,其中HD11（H1N1）分离株明显偏嗜α-2,6受体;5株SIV在MDCK细胞上均复制良好,其中HD11（H1N1）在各取样时间点均具有相对最高的病毒滴度;106.0EID50攻毒剂量下的小鼠实验中,HD11（H1N1）与A/swine/Shandong/SG03（H1N1）这2个分离株表现出明显的致病性,分别导致100%和80%的小鼠死亡率,并在5株受试SIV中具有相对最高的组织病毒载量以及细胞炎性因子水平。进而提示,G4 EAH1N1跨宿主传播的潜能对公共卫生产生的威胁不容忽视,亟需加强监测。