研究背景糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是目前糖尿病最常见的微血管并发症之一,视网膜内皮细胞(Retinal endothelial cells,RECs)在视网膜中发挥许多重要功能,是构成血-视网膜屏障的重要组成部分。在DR早期,RECs功能障碍,促进了DR的进展。研究发现,RECs的炎性凋亡改变在疾病发生发展过程中扮演了重要角色。细胞在免疫炎性反应的刺激下,会发生包括形态学改变在内的一系列变化,引起白细胞介素IL-1,IL-6,IL-8及TNF等炎性因子的表达,通过激活相应的信号传导通路来发挥生物学效应,随着疾病严重程度加重,视网膜内皮细胞炎性反应加重,最终出现细胞凋亡现象。其中p53信号传导通路和NF-κB信号传导通路是诱发细胞凋亡和炎症反应的两条最重要的途径。P53是机体中重要的抑癌基因之一,其可以导致细胞周期停滞、诱导凋亡,在抑制机体多种肿瘤的发生和组织损伤中发挥着重要的作用。P53的蛋白产物可以通过与细胞凋亡相关的靶基因P21、MDM2、Bax相互作用而发挥出潜在的功能,p53能诱导促凋亡基因如Bax、PUMA的表达,亦可以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,直接或间接地导致线粒体膜的去极化,参与细胞凋亡过程。p53亦可以转移到线粒体,导致线粒体膜的去极化,释放促凋亡因子,诱导细胞凋亡的发生。P53基因在DNA修复、阻滞细胞周期、抑制血管生成以及促进细胞非程序性凋亡过程中均扮演了重要的角色。我们的前期实验结果证实,高糖培养的视网膜内皮细胞中促凋亡蛋白Bax及Cl-caspase-3表达升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达出现下降趋势,随着葡萄糖浓度的进一步升高,细胞凋亡趋势增加,此变化是否受p53诱导调控?我们将通过进一步实验加以证实。目前诸多研究已经证实p53与糖尿病及其并发症的发生与发展具有重要的关联性,在这一过程中,P53是否与一些信号通路之间协同发挥作用还是单独起到作用需进一步研究加以证实。NF-κB是一种多向功能调节的转录因子,其主要功能是调控多种基因的表达,包括炎性反应基因、病毒相关基因和原癌基因等的转录表达。NF-κB能被多种因子所激活,引起炎性因子表达的普遍升高,诸如IL-8、IL-6及TNF-α等。我们的前期实验已经证实,高糖诱导的视网膜内皮细胞中IL-1、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子TNF-α的表达随葡萄糖浓度的升高而增加,是否意味着通过激活NF-κB而发挥转录调控作用,尚有待于进一步加以证实。p53是否和NF-κB信号通路在控制相关疾病炎性和细胞凋亡过程中具有协同作用引起了相关学者的兴趣。有研究结果表明,两者在诸多癌症细胞的发生发展过程中表现出相互拮抗,但是在糖尿病相关疾病的研究中表现出协同作用。目前在糖尿病性视网膜病变细胞凋亡机制的研究中二者关系如何未见类似的报道。基于此,本研究采用高浓度葡萄糖作为致炎性因子,模拟视网膜病变的发生与发展过程,对RECs进行形态学观察、凋亡率检测,并检测细胞内炎性因子和凋亡相关蛋白的表达,确定细胞炎性效应及细胞凋亡的基础,在第二部分旨在探讨视网膜内皮细胞凋亡发生机制,了解p53信号传导通路与细胞经典回路NF-κB在其过程中的作用,以期发现二者之间的关系。目的探究高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应,研究p53和NF-κB细胞通路蛋白在人视网膜内皮细胞凋亡中的表达机制和相互关系。材料与方法第一部分:检测高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应将培养对数生长期人视网膜内皮细胞分为三组:实验组为高糖浓度组(HG,30mmol/L),另设正常对照组(Control,5.5mmol/L)、以及以甘露醇(Mannitol)作为高渗对照组(Mannitol,24.4mmol/L)。部分实验根据研究内容不同,设置不同浓度葡萄糖组(15mmol/L、30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L)。于6孔板内加入上述不同成分培养基培养后进行检测。具体检测内容如下:HE染色检测各组细胞形态学变化;透射电镜检测各组细胞细胞器变化;LDH法检测细胞膜损伤;DNA倍体法检测细胞周期;流式细胞仪检测各组细胞凋亡;Western-blot法检测细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Cl-caspase-3浓度表达;ELISA法检测白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子TNF-α浓度表达。进行统计学分析。第二部分:检测高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制实验细胞同第一部分,对细胞进行如下分组:1、高糖浓度组(HG,30mmol/L):细胞在30mmol/L葡萄糖浓度培养基培养12小时;2、高糖+p53抑制剂组(HG+pifithrin-α):细胞培养基内加入10μmol/Lpifithrin-α预处理1小时,然后在30 mmol/L葡萄糖浓度培养基培养12小时;3、正常对照组(Control,5.5mmol/L):细胞在正常葡萄糖浓度培养基中继续培养12小时;4、p53抑制剂对照组(pifithrin-α):细胞培养基内加入10μmol/Lpifithrin-α预处理1小时,然后在正常葡萄糖浓度培养基中继续培养12小时。具体检测项目如下:透射电镜检查细胞形态学变化;Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cl-caspase-3蛋白浓度;Western-blot法检测p53、p-p53、p65、p-p65、IκB、p-IκB蛋白浓度;免疫荧光法检测P53和NF-κB p65蛋白在视网膜内皮细胞的免疫荧光共定位及表达阳性率;q-PCR法检测p53、p65蛋白的mRNA转录水平。进行统计学分析。结果第一部分:检测高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应1、HE染色分析:培养细胞至48小时可以在光学显微镜下见到显著形态学差异,正常对照组细胞呈现正常生长状态,细胞形状均一,有丝分裂活跃,数量较多,细胞间融合较好。随着高浓度葡萄糖溶液培养时间延长,可以观察到视网膜血管内皮细胞整体密度较低,细胞周围出现空隙,细胞内逐渐出现大量空泡和颗粒,细胞形态学发生显著的改变。2、透射电镜分析:在高糖环境中培养12小时后的RECs细胞,细胞膜出现明显凸起现象,细胞内线粒体及高尔基体肿大,线粒体体积增大,视网膜内皮细胞周围可以明显的观察到脂质沉淀,细胞内出现了脂质沉淀累积和明显的空泡现象,同时伴随着大量的初级溶酶体、次级溶酶体甚至是吞噬体出现。3、LDH检测:高糖培养后细胞LDH漏出率显着增加,提示细胞膜损伤,上述改变呈现出浓度依赖性和时间依赖性。4、DNA倍体法检测细胞周期:当高浓度葡萄糖溶液充分作用后,细胞周期的阻滞效应明显,主要停留在G2期,并可见DNA片段形成显著增多,大量凋亡小体形成。5、流式细胞术检测细胞凋亡:高糖诱导视网膜内皮细胞凋亡效应显著,正常细胞比例显著降低,细胞死亡以凋亡为主,凋亡细胞比例显著增多。6、Western-blot检测:高糖溶液培养的RECs,细胞内促凋亡蛋白Bax及caspase-3蛋白的表达显著上升,抑凋亡蛋白Bcl-2下降,结果有显著差异。7、ELISA检测结果:随着葡萄糖浓度的提升,白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子TNF-α的表达均有不同程度的提升,且差异具有统计学意义。第二部分:检测高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制1、透射电镜:高糖培养下的视网膜内皮细胞出现明显的凋亡形态学变化,表现为线粒体中的空泡化,染色质浓缩和内质网的脱颗粒,而在高糖+抑制剂组上述变化显著减轻;2、Western-blot检测凋亡相关蛋白表达:应用pifithrin-α抑制p53蛋白表达后,促凋亡蛋白Bax、Cl-caspase-3表达减少,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达升高;3、Western-blot检测p53和NF-κB通路蛋白:在高糖培养下的RECs细胞,p53、p-p53、p65、p-p65、IκB、p-IκB表达量均有不同程度升高,pifithrin-α抑制p53蛋白表达后,p53表达量显著降低,p-p53/p53比值显著升高,且NF-κB通路蛋白p65、IκB表达量显著降低,p-p65/p65和p-IκB/IκB比值显著降低。4、免疫荧光检测p53和NF-κB p65蛋白表达共定位:高糖组,p53、p65荧光信号呈现强阳性,较正常对照组显著增强,抑制p53蛋白后高糖培养下的RECs细胞p53、p65荧光信号显著降低,以p53蛋白荧光信号降低明显,在细胞核及细胞质内仍可观察到p65荧光信号。5、q-PCR检测p53、p65 mRNA转录水平:高糖组p53、p65的mRNA表达显著升高;抑制p53蛋白后高糖培养下的RECs细胞p53和p65的mRNA表达水平明显降低。结论高浓度葡萄糖可以对视网膜内皮细胞造成实质性损伤,早期即导致其形态学改变;高浓度葡萄糖可激活视网膜内皮细胞凋亡通路和炎症反应通路,导致视网膜内皮细胞凋亡率上升、炎症因子表达增加。P53信号通路参与高糖培养的视网膜内皮细胞的凋亡过程;高糖环境促进p53蛋白以及NF-κB通路活性,使细胞发生炎性反应及细胞凋亡产生;p53抑制剂可抑制p53信号通路和NF-κB信号通路转导,二者在高糖诱导的视网膜内皮细胞炎性凋亡过程中可能起到一定协同作用。