目的：心房颤动(Atrial fibrillation, AF)简称房颤,是临床最常见的快速性心律失常之一,常见于中老年人,可出现肺栓塞、脑动脉栓塞及心功能不全等严重的并发症。目前AF的发生机制学说包括“折返(多发子波折返)”学说、“驱动伴颤动样传导”学说、“肺静脉波”学说和“房颤致房颤(AF begets AF)"理论。AF的发生与动作电位不应期缩短密切相关,而动作电位的去极化与复极化过程则由心肌细胞膜上离子通道的活动决定的。随着AF的发生和维持机制的深入研究,发现离子通道磷酸化在AF时心房肌的病理生理过程中发挥重要的作用。由此,我们推测AF发生和维持的功能性底物是离子通道功能和活性的变化。SK2是小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channels, SK)的一种亚型,主要在人的心房肌中表达。SK2通道的功能与动作电位期间细胞内Ca2+浓度的变化有关,SK2能够迅速将[Ca2+]i的变化转换成细胞膜电位变化,是目前研究AF发生和维持机制的热点离子通道之一。人类心房肌SK2通道上存在蛋白激酶C (Protein kinase C PKC)磷酸化氨基酸序列,但是AF时SK2通道功能发生何种改变,PKC是否对SK2通道具有调节作用及如何发挥调节作用的报道甚少。本研究以人的心房肌细胞作为研究对象,采用全细胞膜片钳技术、Western blotting方法及实时荧光定量PCR方法观察AF时SK2通道电流的变化、PKC相关途径对SK2通道电流的调节作用、PKC蛋白相对表达水平及PKCα、PKCδ、PKCε、PKCθ亚型基因mRNA相对表达水平的变化,旨在探究PKC对人心房肌细胞SK2通道的调节作用及AF发生和维持的可能机制。方法：(一)全细胞膜片钳实验依据患者病历资料及心电图的结果将33例(细胞总数n=20)接受体外循环手术患者的心房肌细胞分为心房颤动组(AF)18例(细胞总数n=10)和窦性心律组(SR)15例(细胞总数n=10)。(1)改良的两步酶分离法获得单个人心房肌细胞：将体外循环术中切除的人右心耳组织置于已充30min氧的Cardiplegic液中,去除脂肪组织并洗去血凝块后,将心房肌组织剪至约1.5mm3,在酶Ⅰ中持续消化20min左右,于倒置相差显微镜下观察到单个心房肌细胞出现后将心房肌组织立即移至酶Ⅱ中继续消化,此过程持续给氧并于37℃水浴箱中进行,当大量立体感强、横纹清晰、细胞膜完整、折光性好的心房肌细胞出现后立即停止消化。(2)记录人心房肌细胞SK2通道电流：将两步酶分离法得到的人心房肌细胞置于全细胞浴液中,选择细胞膜完整、贴壁良好、表面光滑、折光性强的单个心房肌细胞作为研究对象,全细胞膜片钳模式下给予人心房肌细胞记录SK2通道电流的刺激方案：保持电位为-55mV,测试电压从-130mV到+50mV (10mV阶跃),记录内向整流混合电流,向全细胞浴液中加入SK2通道的特异性阻断剂apamin (0.1μmol/L)后,再次记录内向整流混合电流,加药前与加药后的混合电流相减即SK2通道电流。观察和比较SR组和AF组SK2通道电流的变化及PKC激活剂佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)对SK2通道电流的调节作用。(二)Western blotting实验：AF组18例和SR组23例心房肌组织作为研究对象,于液氮中将组织捣碎成粉末,根据组织量的多少加入适量的Lysis buffer裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取心房肌组织总蛋白并测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上,抗体孵育,Bio-Rad凝胶成像系统迅速检测成像,采用Quantity One软件分析处理所得图像,以GAPDH为内参照,比较SR者和AF患者PKC蛋白相对表达水平的变化。(三)实时荧光定量PCR实验：依据病历资料及心电图诊断将29例病人分为AF组16例和SR组13例。用Trizol试剂盒提取体外循环手术中切除的人心房肌组织总RNA,紫外分光光度计测定OD260/OD280,分别计算SR组和AF组总RNA的浓度与纯度并进行统计学分析,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA分子的完整性。利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术将提取的总RNA逆转录成cDNA,以(3-actin为内参照基因,采用SYBR GreenⅠ法实时荧光定量PCR技术检测SR者和AF患者PKCα、PKCδ、 PKCε、PKCθ亚型基因mRNA水平的变化。结果：(1)人心房肌细胞中SK2通道电流的基本特性本实验记录的人心房肌细胞SK2通道电流具有内向整流特性且能被apamin特异性阻断。(2)SR组与AF组SK2通道电流的比较常规全细胞膜片钳模式下记录SK2通道电流,发现在-130mV～-80mV钳制电压下,SR组和AF组SK2通道电流密度的差异有统计学意义。在-130mV钳制电压时,SR组和AF组SK2通道电流的电流密度分别为(-5.10±0.32)pA/pF、(-10.71±0.73)pA/pF(nSR=5,nAF=5,P<0.05),SK2通道电流在混合电流中所占的比例分别为(23.20土1.09)%、(32.87±1.81)%(nSR=5,F/AF=5,P<0.05),比较SR组与AF组的结果发现：AF组SK2通道电流密度及SK2通道电流在混合电流中所占的比例明显大于SR组。(3)PKC激活剂PMA对SR组和AF组SK2通道电流的调节作用10∴mol/LPKC激活剂PMA可降低SR组和AF组SK2通道电流密度及SK2通道电流在混合电流中所占的比例。与未经PMA预处理的SK2通道电流相比,PMA预处理后SR组和AF组分别在-130mV～-80mV、-130mV～-70mV钳制电压下,电流密度减小的差异有统计学意义。在-130mV钳制电压时,PKC对SR组和AF组SK2通道电流的抑制比分别为(8.39±0.80)%、(20.9±0.70)%(nSR=5,nAF=5,P<0.05),结果显示PKC对AF组的抑制比明显大于SR组。(4)SR组和AF组PKC蛋白相对表达量的变化SR组和AF组PKC蛋白表达量分别为1.37±0.09.1.00±0.10(nSR=23,nAF=18,P<0.05),AF组PKC蛋白表达水平降低。(5)AF组PKCα、δ、ε、θ基因mRNA的变化采用2-△△Ct法分析SR组和AF组PKCα、PKCδ、PKCε、 PKCθ mRNA水平的相对表达量。实时荧光定量PCR结果表明,AF组PKCα、PKCδ、PKCε、PKCθ分别为SR组的0.21、0.55、2.77、1.54倍,AF患者心肌细胞PKCα、δ基因mRNA相对表达水平下调,PKCε、θ基因mRNA相对表达水平上调(nSR=13, nAF=16, P<0.05)。结论：(1)人心房肌细胞SK2通道具有apamin敏感性,通道电流具有内向整流特性。(2)AF时心房肌细胞SK2通道电流上调,活动增强,提示SK2通道活动参与了AF的发生和维持。(3)AF时,PMA.激活PKC后可下调SK2通道电流,且对AF患者SK2通道电流的下调作用大于SR者,提示PKC可通过某种途径在一定程度上调节人心房肌细胞SK2通道功能且对AF时SK2通道发挥更明显的调节作用,PKC对SK2通道的调节可能成为临床治疗AF的靶点。(4)AF时心房肌组织中PKC蛋白相对表达水平下调,PKCα、PKCδ基因mRNA水平明显下调及PKCε、PKCθ基因mRNA水平上调可能参与AF发生和维持的病理生理过程。