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恶性肿瘤的治疗一直是个难以攻克的世界难题,究其原因主要有两个方面,一方面是因为传统的细胞毒类抗肿瘤药物缺乏选择性,易诱导肿瘤细胞产生耐药性;另一方面是因为肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）的存在增加了肿瘤转移复发的机率。CSCs是一类具有高致瘤性,保留了类干细胞样无限增殖能力和多向分化潜能的细胞,此类细胞虽然在肿瘤组织中数量较少,却在肿瘤的发生发展中起到关键作用。为了杀灭CSCs和克服肿瘤细胞耐药,目前临床多将不同作用机制的抗肿瘤药物共同给药,利用药物之间的协同作用提高抗肿瘤疗效。但由于每种药物理化性质差异巨大,给药途径也不完全相同,单纯的联合给药方案易导致患者耐受性差,依从性不高,经济负担重。因此,寻找一种同时具有多种作用机制的新型多功能抗肿瘤药物成为当下药学领域的研究热点。本研究结合肿瘤细胞的信号传导特点和抗肿瘤药物的理化特征,在课题组前期研究基础上以全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）、达沙替尼（Dasatinib,DAS）为模型药物,设计并制备出多功能靶向自组装纳米粒（DAS/ATRA-NPs）,构建了不仅具有抗普通肿瘤细胞能力和抗CSCs潜力双重作用机制,理论上还具有肿瘤被动靶向作用和肿瘤小分子蛋白主动靶向作用的多功能肿瘤靶向治疗策略。前言部分主要阐述了ATRA和DAS在肿瘤治疗学方面的研究背景及其应用价值,为本课题提供了充分的理论支持。本文第一章初步考察了ATRA对高致瘤性小鼠黑色素瘤B16F10细胞生物行为学的影响。MTT实验发现ATRA能呈剂量依赖性地抑制B16F10细胞的增殖能力;用中浓度（16μmol/L）的ATRA处理B16F10细胞24 h后,细胞划痕实验显示ATRA能有效抑制B16F10细胞的体外迁移能力;镜下可观察到细胞形态明显发生改变,DAPI核染色可见凋亡小体,流式细胞仪测得其细胞凋亡率为（37.27±4.42）%;体内成瘤实验进一步提示ATRA能显著抑制B16F10细胞的致瘤性,这为本课题选择ATRA作为抗CSCs靶向药物提供了实验依据。本文第二章结合DAS、ATRA药物理化性质,通过超声乳化溶剂蒸发法合成制备出了多功能靶向自组装纳米粒（DAS/ATRA-NPs）。实验先通过单因素处方分析考察了DAS、ATRA的投药比、有机相中DCM与EtOH的比例、有机相与水相的比例、超声功率以及超声时间对DAS/ATRA-NPs的Size、PDI、Zeta Potential、药物包封率（Encapsulation efficiency,EE%）的影响。优化了制备工艺后所制得的DAS/ATRA-NPs呈淡黄色,外观均匀透亮,无肉眼可见颗粒物。透射电镜下观察到纳米粒呈大小约100200 nm的均一椭球形颗粒,激光粒度分析仪测得DAS/ATRA-NPs的Size为（172.57±1.64）nm,PDI为（0.26±0.04）,Zeta Potential为（32.10±0.65）mV。HPLC测得DAS/ATRA-NPs中DAS、ATRA的包封率分别（83.61±4.45）%、（95.21±1.09）%。将新制DAS/ATRA-NPs置于4℃条件下储存4周,连续监测Size、PDI和Zeta Potential的变化,发现DAS/ATRA-NPs在4℃储存条件下各参数无明显变化,稳定性良好。实验采用透析法考察DAS/ATRA-NPs体外释放速度,用含20%乙醇的PBS（PH=7.4）作释放介质,发现DAS/ATRA-NPs中的DAS与ATRA累积释药量均小于游离DAS和游离ATRA,表明DAS/ATRA-NPs体外具有一定的缓释能力。本文第三章以人肝癌HepG2细胞为研究对象,着重考察了DAS/ATRA-NPs的体外抗肿瘤效果。实验首先用香豆素-6对DAS/ATRA-NPs进行标记,利用香豆素-6的荧光特点在激光共聚焦下观察到DAS/ATRA-NPs主要存在于HepG2细胞的胞质中。在MTT细胞毒性实验中发现DAS/ATRA-NPs能呈浓度依赖性地抑制HepG2体外增殖,24 h的IC50为12.72μmol/L,药物协同指数CI50为0.96,表明DAS和ATRA两者药效具有协同作用。继以含12.5μmol/L药物浓度的培养基处理细胞,发现DAS/ATRA-NPs能显著抑制HepG2细胞的侵袭迁移能力。给药24 h后,各组HepG2细胞开始发生凋亡,流式细胞仪测得游离ATRA、游离DAS、DAS+ATRA物理混合组、DAS/ATRA-NPs组的细胞凋亡率分别为（14.68±3.25）%、（21.55±1.63）%、（26.98±3.42）%、（45.77±3.30）%,相比各对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。随后,线粒体膜电位实验和Caspase凋亡蛋白荧光实验则表明DAS/ATRA-NPs促凋亡的机制可能与线粒体凋亡途径有关。细胞侧群实验发现正常HepG2细胞中侧群细胞比例（SP）为（1.61±0.12）%,DAS和ATRA两药分别给药和混合给药处理HepG2细胞24 h后,SP比例均有减少,分别为（1.11±0.12）%、（0.89±0.03）%、（0.58±0.02）%,而DAS/ATRA-NPs组的SP比例为（0.35±0.00）%,虽稍弱于阳性对照维拉帕米组（0.21±0.05）%,但DAS/ATRA-NPs对SP的抑制作用明显优于DAS、ATRA分别给药和混合给药组,说明DAS/ATRA-NPs中两药应具有协同抗CSCs的作用。本文第四章将DiD标记过的DAS/ATRA-NPs经尾静脉注射入SD大鼠体内,通过检测不同时间点血浆中DiD的荧光强度而得出DAS/ATRA-NPs在SD大鼠体内药动学曲线并计算药动学参数。实验发现游离DiD体内消除半衰期为4.61 h,标记后的DAS/ATRA-NPs消除半衰期为20.86 h,提示DAS/ATRA-NPs在体内同样具有缓释效果。裸鼠体内成瘤实验发现DAS/ATRA-NPs组肿瘤致瘤率比对照组低,且DAS/ATRA-NPs组肿瘤体积显著小于对照组肿瘤体积（P<0.05）,说明DAS/ATRA-NPs能显著抑制HepG2细胞体内成瘤能力,在抗CSCs方面具有一定研究价值。综上所述,本文探索了一种新的恶性肿瘤靶向治疗方案,不仅在理论上丰富了恶性肿瘤治疗领域的研究内容,所构建的多功能自组装纳米粒（DAS/ATRA-NPs）也有望为多功能靶向抗肿瘤药物的研发提供新思路。