以多环芳烃（PAHs）为代表的芳香类环境污染物对生态环境和人类健康具有严重危害。微生物被视为全球物质循环的引擎,以其作为主体的生物修复法在治理多环芳烃污染中具有重要的研究价值。恶臭假单胞菌是一类非致病性的环境友好菌株,可以高效代谢多种芳香化合物,是消除环境中PAHs污染物的最佳选手之一。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）B6-2是本课题组前期从联苯污染土壤中筛选到一株“超级”菌株,能够高效、多样化、深度地降解多种芳香化合物,且具备有机溶剂耐受能力,对复合污染环境具有极大的生物修复潜力。但是该菌株代谢芳香化合物的分子机理仍未解析清楚,在实地污染环境的生物修复应用中缺少理论指导。本文从多组学数据分析着手,结合分子生物学方法寻找芳香化合物代谢关键基因,揭示假单胞菌代谢联苯的调控机理,全面系统地揭示假单胞菌分解代谢芳香化合物的分子机理,并挖掘假单胞菌高值转化环境污染物实现变废为宝的潜力。（一）菌株B6-2全基因组、转录组和蛋白质组学的综合分析。通过3代测序技术获得菌株B6-2全基因序列,共包含6,377,261个碱基,5,832个编码基因。经过RAST注释和BLAST比对分析,解析了菌株B6-2中的芳香化合物代谢网络,并在基因组上定位了关键芳香化合物代谢基因（簇）的位置。通过对转录组数据中差异转录基因进行功能聚类分析,证明基因转录谱与不同碳源之间具有显著相关性,表明转录组数据结果的可靠性。当以联苯为唯一碳源培养细菌时,对应代谢相关基因家族转录水平显著上调,如“联苯降解途径”,“苯甲酸降解途径”,“邻苯二酚分支途径”和“芳香化合物降解的中心元裂解途径”等。通过对蛋白质组数据进行不同的分组比较分析,发现聚类于O类（翻译后修饰,蛋白质周转,分子伴侣）,J类（翻译,核糖体结构和生物发生）,E类（氨基酸转运和代谢）的上调蛋白的数量,以及C类（能量产生和转化）的蛋白在联苯及混合培养基（联苯、二苯并呋喃、咔唑、二苯并噻吩）中表达水平高于其他家族蛋白。此外,在混合培养基培养时,K类（转录）和U（细胞内运输,分泌和囊泡运输）等上调表达蛋白数量占优,推测该类蛋白可能在菌株B6-2共代谢非可利用碳源时发挥重要作用。（二）假单胞菌中芳香化合物代谢重要功能基因的筛选。基于组学数据中上调表达的基因,对菌株B6-2中趋化、氧化还原、外膜蛋白及转运相关等目标基因进行无痕敲除,共获得19株敲除突变株,发现敲除株B6-2△2426&2429,B6-2△2445和B6-2△4751的联苯代谢能力受到对应基因缺失的影响。通过定量PCR实验与基因敲除实验验证了3种邻苯二酚双加氧酶在代谢不同芳香族碳源时所发挥的功能主次关系。通过构建随机插入文库,筛选到9株目标突变株并定位了转座子的插入位点。对转座子插入基因的序列比对分析发现有7株（A17、B35、D65、D85、E24、L30和L32）突变株属于营养缺陷型突变,另外2株突变株C4和N25可能是由于联苯代谢直接相关功能基因被插入失活造成。菌株B6-2在LB富营养培养基连续传代至100代时,有48%的菌株丢失了联苯代谢能力,而KF707中的联苯代谢基因簇则相对稳定。没有发现菌株B6-2联苯代谢基因簇可以水平转移的现象。（三）假单胞菌中联苯及水杨酸代谢调控基因的功能研究。GntR家族调控基因bphR1位于菌株B6-2联苯代谢基因簇上游,该基因失活的突变株仍保留联苯代谢能力;LysR家族调控基因bphR2位于水杨酸代谢基因簇上游,该基因失活的突变株丢失水杨酸代谢能力。RT-qPCR数据推测BphR1是联苯代谢基因簇的诱导激活蛋白,但BphR1不是联苯代谢所必需的。敲除株B6-2dbphR2在水杨酸培养下水杨酸羟化酶编码基因salA转录水平很低,表明BphR2对下游水杨酸基因簇转录起到明显激活作用。通过5’RACE方法分析了基因bphR1、bphA1、bphR2和salA上游的转录起始位点。（四）假单胞菌高值转化氮杂环污染物。利用假单胞属的工程菌作为生物催化剂,以废次烟叶中尼古丁作为催化底物,制备高值中间产物3-琥珀酰吡啶,将环境污染物变废为宝。全细胞催化反应过程耗能低,同时可提供还原力,能够实现底物的持续转化,全细胞催化剂重复利用3次后仍可保留80%以上的催化活性。通过反应条件优化,分别进行了补料和分批-补料方式发酵制备3-琥珀酰吡啶,最高产物浓度达到9.8 g l^-1,利用减压蒸馏及酸降方法获得3-琥珀酰吡啶晶体,转化率达到54.2%。