STIM1-shRNA真核表达载体的构建及稳定低表达STIM1 SGC7901细胞系的建立

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目的:利用RNA干扰(RNA interference)技术,构建针对STIM1基因的短发夹环状小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,并将其稳定转染人胃癌细胞株SGC7901(Human Gastric carcinoma cell line SGC7901),建立STIM1稳定表达细胞株,为进一步研究STIM1基因在胃癌发生发展中的功能作用奠定坚实的基础。  方法:利用GenBank数据库检索STIM1基因的核苷酸序列,根据shRNA设计原则,设计并合成3段特异性的小干扰片段,1段阴性对照组,将其定向克隆到载体pGPU6/GFP/Neo中重组构建RNA干扰质粒,并对重组载体测序鉴定。通过阳离子脂质体介导重组载体转染SGC7901细胞后,采用Western blot检测筛选出沉默效率最高的重组载体,同时利用G418抗性筛选,建立稳定STIM1低表达的人胃癌细胞SGC7901系。  结果:经测序分析证实,靶向STIM1基因的3个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体构建成功,分别命名为pGPU6/shSTIMI-1,2,3,阴性对照组命名为pGPU6/shSTIM1-NC。Western blot检测结果显示pGPU6/shSTIM1-3可显著抑制SGC7901细胞中STIM1蛋白的表达,干扰效率达82%左右。稳定转染pGPU6/shSTIM1-3质粒的细胞经G418(500μg/ml)筛选后,得到阳性克隆命名为SGC7901/pGPU6/shSTIM1细胞株。经传代10次以上后,Western blot检测结果显示干扰效率达81%。  结论:成功构建了针对STIM1基因的shRNA真核表达载体,并建立了稳定转染STIM1基因的人胃癌细胞SGC7901系,为进一步研究STIM1基因的功能奠定了良好的实验基础。
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