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褐藻是海洋中产量丰富的生物质资源,是可持续能源开发的天然宝库。褐藻胶是广泛存在于褐藻细胞壁间,由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸两种单体通过1,4-糖苷键连接而成的聚合物,是褐藻生物质中的重要组分。国际上已有众多机构和学者开展了褐藻胶的生物质转化研究,但往往由于褐藻胶裂解酶酶活低或酶解不彻底等问题,阻碍了褐藻生物质的广泛应用。因此,褐藻胶裂解酶高产菌株的筛选依旧是当前褐藻胶利用的重要工作之一。基于此,本研究以筛选褐藻胶降解菌为主线,从以褐藻为食的鲍鱼入手,首先对鲍鱼肠道微生物多样性进行调研,其次将所分离到的菌株进行褐藻胶降解能力的检验,对筛选到的具有高活性褐藻胶降解菌株Agarivorans sp.B2Z047产酶的最佳培养条件进行了研究,同时对前期研究中分离到的三株细菌新物种进行了多相分类。研究成果如下:一、基于纯培养法对鲍鱼肠道微生物进行了多样性分析。以鲍鱼的直肠内容物和内脏团混合物分别作为样品,对消化道内可培养微生物多样性进行分析。将样品稀释涂布于含有0.5%海藻酸钠的2216E固体培养基上,于20℃的恒温培养箱中培养7天后进行细菌分离。从两个样品中共计分离到364株细菌,经过16S rRNA基因序列在线比对,这些细菌归属于4个门、16个科、44个属、87个物种:其中65个物种属于变形菌门,弧菌属和希瓦氏菌属为优势类群;拟杆菌门有18个物种,它们均属于黄杆菌科;而放线菌门和厚壁菌门各只分离到了 2个物种。所分离的菌株中,27株细菌为潜在新菌。二、基于16S rDNA高通量测序对鲍鱼肠道微生物的多样性进行了分析。将鲍鱼的直肠内容物和内脏团混合物的原始样品和7天、15天的富集液共计6个样品进行16S rDNA基因高通量测序并进行在线分析。所有样本的有效测序数量均在35000条以上,所有样本共计测得328个OTU,它们分布在21个门、29个纲、74个目、117个科、181个属。在富集过程中,两个样品的微生物区系发生了不同的变化:随富集时间的延长,内脏团样品的微生物多样性先升高后降低,而直肠样品的微生物多样性呈逐渐降低的趋势。两个原始样品的优势菌群有所区别:内脏团中以拟杆菌门的济州岛古名菌属(Tamlana,占63.3%)为优势类群,其次为弧菌属(Vibrio,15.0%)、华美菌属(Formosa,6.4%);直肠中微生物多样性较为丰富,以柔膜菌门(Tfenericutes)的Mycoplasma属(30.6%)数量最多,其次为冷单胞菌属(Psychromonas,25.6%)和一些未被归类的others(12.1%),弧菌属仅占1.1%。鲍鱼直肠微生物多样性比内脏团微生物多样性高。三、对分离到的所有细菌进行初筛和复筛,筛选出一株降解褐藻胶能力较强的菌株B2Z047,测其基因组并对该菌株的褐藻胶裂解酶基因进行了分析。通过平板初筛,从分离到的364株细菌中初步鉴定出100株细菌具有褐藻胶降解能力,占分离细菌总数的27%,其中44%的褐藻胶降解菌属于Vibrio。选取在平板上褐藻胶降解圈较大的30株细菌进行摇瓶复筛,筛选并获得多株液体培养下降解褐藻胶能力较强的菌株,其中菌株B2Z047降解褐藻胶的能力最强,初始酶活达到0.23 U/mL,高于实验室已保藏的菌株的产酶活性。基于16S rRNA基因多序列比对,其与模式物种的16S rRNA基因的最高相似度为98.77%,是噬琼胶菌属(Agarivorans)的一员,为潜在新菌。四、对菌株B2Z047进行了基因组测序,根据基因组草图对该菌株的褐藻胶裂解酶基因进行了分析。根据菌株B2Z047基因组草图,预测到该菌基因组中含有8条褐藻胶裂解酶基因。经初步鉴定,这些褐藻胶裂解酶归属于PL6、PL7和PL5多糖裂解酶家族;这些酶均含有信号肽,亲水值均为负值,在以大肠杆菌和酵母菌为宿主进行异源表达时的半衰期均大于10 h,除AlgA2、AlgA6、AlgA8含有单结构域外,其它5个酶均含有多个功能结构域,预测结果均显示,8条褐藻胶裂解酶均适合进行异源表达。五、对菌株B2Z047褐藻胶裂解酶的产酶条件进行了优化,确定了摇瓶发酵的最佳培养基和最佳培养条件。通过单因素分析,该菌产酶的最佳碳源是海藻酸钠且为非诱导型;该菌产酶的最佳氮源是酵母粉,对有机氮源利用的偏好性高于无机氮源。通过正交试验确定了菌株产酶的最佳培养基配方:海藻酸钠1.1%,酵母粉0.3%,氯化钠1.0%,硫酸镁0.1%,天然海水配制。在最佳培养基的基础上对多种培养条件进行了优化,经实验分析,该菌株在培养温度为25℃、初始pH为8.5、摇瓶转速为175 rpm、接种量2%、摇瓶装液量在满足试验条件下尽量少一些时,菌株发酵液的酶活较高。将菌株在最佳条件下进行培养,最高酶活较优化前提高了 1.17倍,这一研究结果为后期实验奠定了基础。六、对三株细菌新物种进行了多相分类。菌株T58T分离自威海近海,具有褐藻胶降解能力,经多相分类,其为Hyunsoonleella属的一个新物种,分类地位明确,将其命名为Hyunsoonleella flava,标准菌株为 T58T(=KCTC 72081T=MCCC 1H00359T)。菌株 WD6-1T分离自文登盐场,生有极生鞭毛和细菌柄,经多相分类,其为Marinicauda属的一个新物种,命名为Marinicauda salina,标准菌株为 WD6-1T(=KCTC 62348T=MCCC 1H00282T)。菌株XYN52T分离自云南省星云湖,经多相分类,其为Pelagibacterium属的一个新物种,命名为Pelagibacteriumlacus,标准菌株为XYN52T(=KCTC 62845T=MCCC 1H00348T)。