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乙型病毒性肝炎是一种世界性的传染病,由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染所引起,是肝衰竭、肝硬化和肝癌发生的高危因素。HBV由于其多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,极易发生变异,是高变异病毒,其内部基本核心启动子(basal core promoter, BCP)基因序列的保守性对于维持病毒的活跃复制非常关键,该区变异可以影响HBV的复制力,降低病毒e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)的合成,从而导致不同的临床结局。目前,BCP区的热点突变有T1753A/C、A1762T、G1764A、C1766T等,其中最为常见的是A1762T/G1764A双联突变,此外,C1766T/T1768A双联突变,以及A1762T/G1764A/C1766T和T1753C/A1762T/G1764A/C1766T等多联突变也较为常见。本实验通过对解放军第302医院近年收治的40例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者及40例慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)患者HBV全基因组的克隆及热点突变的统计分析,并进一步挑选BCP区G1764A/C1766T/T1768A三联突变样品,研究该突变对启动子活性和HBV全基因组复制力的影响。本研究的主要结果如下:1.患者临床资料经统计分析后发现,CHB患者的HBeAg阳性率和HBV DNA载量高于ACLF患者(P<0.05),而总胆红素(total bilirubin, TBIL)含量则低于ACLF患者(P<0.05),提示以上因素与乙型肝炎重症化可能存在相关性。2.通过对80例血清样本的全基因组克隆及对BCP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中发生频率为0.0%(0/40),而在ACLF患者中发生频率高达12.5%(5/40)(P<0.05),提示该突变与乙型肝炎重症化可能存在相关性。3.运用MEGA 4.0软件对HBV全序列构建进化树进行HBV基因分型,其中40例CHB患者中,B型9例占22.5%;C型30例占75.0%;D型1例占2.5%;40例ACLF患者中,B型8例占20.0%;C型31例占77.5%;D型1例占2.5%;两组患者未发现基因型分布的差异。4.构建pGL3-BCP荧光素酶报告载体,经过定点突变及细胞转染技术,双荧光素酶的检测结果显示:典型BCP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍,提示该三联突变对启动子活性具有上调作用。5.HBV全基因组经过定点突变及细胞转染技术,荧光定量检测结果显示:典型BCP双联突变A1762T/G1764A病毒株的全基因组复制力为相应野生株的1.56倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的全基因组复制力为相应野生株的1.54～2.49倍,提示该突变可以增加HBV DNA的复制水平。总之,通过对CHB患者和ACLF患者HBV全基因组的克隆及序列分析,以及BCP区G1764A/C1766T/T1768A三联突变对启动子活性以及病毒全基因组复制水平影响的研究,明确了该三联突变的生理功能,有助于理解HBV DNA BCP突变特征及在乙型肝炎的重症化进程中的分子病毒学机制。