背景脓毒症为机体感染所导致的全身炎症反应综合征,其英缩写为SIRS,脓毒症患者处于发病期间,其全身各种组织器官共同参与这一过程。这种疾病在致使重症监护室患者死亡方面排在全球的首位,严重威胁患者生命健康,同时亦给社会和家庭带来子巨大经济压力,同时生物机体的免疫反应亦在该过程中扮演着重要角色。在脓毒症发生时,机体同时存在免疫抗击以及免疫抑制,两者处于动态平衡状态。除此之外,抗炎以及促炎反应亦参与了脓毒症的发生。脓毒症发生的临床表现往往呈现出多样性,即没有其标志性的临床表现,因此越来越多的研究者将目光转移到寻找脓毒症特异性生物学标志物的研究上来,以期将之应用于脓毒症的临床诊断、治疗以及预后评价中。迄今为止,已有多种脓毒症相关分子标志物被陆续发现,其中包括与凝血和炎症反应相关的分子标志物,如C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、降钙素原等,目前这些分子标志物已有部分被应用于临床。但在目前所使用的上述分子标志物中均存在敏感性过高以及特异性不强等缺点,因此应用于诊断脓毒症往往结果并不理想;评分系统虽然能够用于对脓毒症患者的预后情况以及病情的严重程度进行评价,但却不能应用于脓毒症的诊断,同时亦不能够应用于脓毒症的治疗当中。所以寻找新的脓毒症诊断、治疗以及判断预后的分子标志物成为目前医学界亟待解决的问题。miRNA为一类非编码小RNA分子,成熟miRNA的长度为18～25个核苷酸,通过生物机体可以快速识别特定目标的mRNA,全面调控mRNA的降解,还可以转录调控其翻译过程。生物机体中miRNA与一系列生命活动过程相关,其中包括细胞的生长、增殖、分化、凋亡、肿瘤发生以及机体免疫等。目前已有大量研究证实,miRNA与脓毒症的发生和发展密切相关。miR-29为一类miRNA,在人体的肺、肾脏、心脏等组织细胞中呈高表达状态。miR-29a为miR-29家族中的重要成员之一,其在生物机体一系列生理和病理过程中发挥着重要作用,但目前尚未有miR-29a与脓毒症发生和发展相关性的研究。STATs,即以激活因子为中心,进行信号转导及转录,属于由酪氨酸蛋白激酶活化的转录因子,存在于细胞浆中,具有介导细胞反应性以及增生性信号的功能。JAK/STAT信号转导通路中的主要成员包括JAKs以及STATs蛋白家族。目前的研究已经证实,STATs蛋白家族为JAKs的底物,STAT能够通过促进炎症介质的表达从而影响脓毒症的发生和发展。STATs蛋白家族能够通过介导多种细胞因子的表达,从而调控生物机体中一系列生理过程,其中包括细胞生长、分化、增殖以及凋亡等。STAT3为STATs家族的重要成员之一,在生物机体中STAT3相关信号转导通路与多种生长因子以及细胞因子介导的信号转导过程之间存在密切联系,从而参与了一系列生理和病理过程。STAT3能够通过调控相应靶基因,以便加速细胞增殖、有效组织细胞凋亡的速度,改善细胞恶变的现象。不同的JAK/STAT信号通路在脓毒症的发生和发展过程中往往会具有不同作用,其中JAK2/STAT3通路在脓毒症引起的多器官功能障碍的发展过程中扮演着十分重要的角色]。通过人为手段阻断JAK2/STAT3信号通路能够进而阻断脓毒症发生过程中引起的过激炎症反应,此外还能同时抑制机体过度抗炎反应的发生,最终发挥保护组织器官的功能。目的本研究拟通过检测miR-29a在脓毒症患者外周血白细胞中的表达,探讨其与脓毒症患者预后以及血清中炎性因子的相关性,同时分析miR-29a表达的改变对LI-10诱导的人外周血单核细胞系THP-1增殖、凋亡以及细胞周期的影响;除此之外,我们还利用生物信息学软件对miR-29a的靶基因进行预测并进行验证。本研究旨在旨在为了解miR-29a在脓毒症发生和发展过程中的作用机制,同时为脓毒症的临床诊断,进行靶向治疗给予强大的后援。方法(1)选取2015年8月至次年8月期间于XXX医院重症监护室(intensive care unit,ICU)收治的脓毒症患者外周血样本为对象,共40例;采集同期于XXX医院重症监护室(ICU)收治的SIRS患者外周血样本,共35例;同时采集10例同期于XXX医院门诊进行健康检查的健康志愿者外周血样本,共10例。荧光定量PCR检测上述血液样本中mIR-29a的表达水平,ELISA法检测血清中IL-10和TNF-α的含量。分析miR-29a与IL-10、TNF-α的相关性。(2)ELISA法检测不同患者来源的单核细胞以及用20 ng/mL LPS作用后的THP-1细胞中IL-10蛋白的表达情况。设计并合成miR-29a inhibitor,将之转染THP-1细胞用以抑制细胞中miR-29a的表达。荧光定量PCR检测转染后细胞中miR-29a的表达量。用20 ng/mLLPS作用于转染后的THP-1细胞,MTT法检测细胞的增殖活性,Hoechst染色法检测细胞的凋亡率。(3)将 LPS(20 ng/ml)和 LPS+ IL-10(10 ng/mL)分别作用于 THP-1 细胞,MTT法检测细胞的存活率,流式细胞术检测细胞的凋亡率;western blot法检测细胞中STAT3和p-STAT3蛋白的表达。运用生物信息学软件对miR-29a的靶基因进行预测。分别构建STAT3 3’UTR WT(野生型)和STAT3 3’UTR Mut(突变型)质粒载体并将之分别与miR-29amimic共转染HTP-1细胞,检测细胞中荧光素酶报告基因的表达。将miR-29amimic分别转染来自于健康志愿者外周血的单核细胞以及培养的人单核细胞THP-1,采用荧光定量PCR和western blot法分别检测上述细胞中STAT3 mRNA和蛋白的表达。将miR-29a和/或STAT3慢病毒载体转染THP-1细胞,随后用20 ng/ml LPS作用于上述细胞,流式细胞术检测转染后细胞的凋亡率,MTT法检测细胞的存活率。结果(1)荧光定量 PCR检测结果表明,对照组患者血浆中miR-29a的相对表达量为 0.235±0.110、脓毒症组患者为 0.733±0.126、SIRS组患者为0.419±0.093。与对照组相比,脓毒症组患者血浆中miR-29a的表达水平明显增高(t=3.122,P=0.035<0.05);与对照组相比,SIRS组患者血浆中miR-29a的表达水平明显增高(t=2.091,P=0.044<0.05);与SIRS组患者相比,脓毒症组患者血浆中miR-29a的表达水平明显增高(t=2.322,P=0.046<0.05)。ELISA检测结果表明,对照组患者血清中IL-10的表达量为(233.175±25.624)pg/mL、脓毒症组患者为(549.367±30.098)pg/mL、SIRS 组患者为(331.119±29.033)pg/mL。与对照组相比,脓毒症组患者血清中IL-10的表达水平明显增高(t=4.355,P=0.029<0.05);与对照组相比,SIRS组患者血清中IL-10的表达水平明显增高(t=3.761,P=0.041<0.05);与SIRS组患者相比,脓毒症组患者血清中IL-10的表达水平明显增高(t=2.716,P=0.043<0.05)。对照组患者血清中TNF-α的表达量为(189.233±19.259)pg/mL、脓毒症组患者为(411.189±24.106)?g/mL、SIRS组患者为(290.611±22.735)pg/mL。与对照组相比,脓毒症组患者血清中TNF-α的表达水平明显增高(t=6.811,P=0.023<0.05);与对照组相比,SIRS组患者血清中TNF-α的表达水平明显增高(t=4.655,P=0.038<0.05);与SIRS组患者相比,脓毒症组患者血清中TNF-α的表达水平明显增高(t=4.316,P=0.044<0.05)。miR-29a与IL-10呈正相关(r=0.407,P=0.041<0.05);对脓毒症患者外周血中miR-29a的表达与TNF-α含量之间的相关性进行统计学分析,结果表明miR-29a与 TNF-α 呈正相关(r=0.576,P=0.038<0.05)。ELISA检测结果表明,与对照组相比,各脓毒症患者单核细胞中IL-10的表达量均明显增高(P<0.05)。采用ELISA法对用20 ng/mL LPS作用后THP-1细胞在0、4、8、12 h时IL-10的表达水平进行检测,结果表明随着时间的推移,LPS作用后人单核细胞THP-1中IL-10的表达水平逐渐增高。荧光定量PCR检测结果表明,与control组相比,miR-29a inhibitor组细胞含有miR-29a表达能力呈现下降趋势(P<0.05),已经顺利建立了 THP-1细胞,可以对miR-29a起到表达抑制的效果。经过MTT法可以发现,较之于照组显而言,THP-1细胞经过转染miR-29a inhibitor以后,其分别于48 h、72 h、96 h的组织率得到很大的提升(P<0.05)。Hoechst染色法检测结果表明,miR-29a inhibitor组细胞凋亡率明显低于对照组组(P<0.01)。(2)随着时间的延长,对照组和IL-10作用组细胞中细胞的存活率均逐渐增高;其中相较于对照组,IL-10处理组细胞各时间点的存活率明显高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,IL-10作用组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。随着时间的推移,STAT3和p-STAT3蛋白的表达水平逐渐增高。生物信息学软件预测结果表明,STAT3为miR-29a的靶基因。与对照组相比,miR-29a mimic与STAT33’UTR WT共转染组已经在不断降低其荧光素酶表达量(P<0.05);与对照组对比,miR-29a mimic与STAT3 3’UTR Mut共转染组,两者的荧光素酶表达量基本不变(P>0.05)。在分离自健康志愿者外周血的单核细胞中,当miR-29a表达上调后能够明显抑制细胞中STAT3 mRN和蛋白的表达(P<0.05);在培养的人单核细胞THP-1中,当miR-29a表达上调后能够明显抑制细胞中STAT3 mRN和蛋白的表达(P<0.05)。与miR-control组相比,miR-29a组细胞的凋亡率明显增高(P<0.05);而miR-control+STAT3组细胞的凋亡率则明显降低(P<0.05);而miR-29a+STAT3组细胞的凋亡率与miR-control组相比无显著差异(P>0.05)。miR-29a组在1、3、4、5 天时细胞的存活率明显低于 miR-control 组(P<0.05);miR-control+STAT3组细胞的存活率明显高于miR-control组(P<0.05);而miR-29a+STAT3组与miR-control组相比无明显差异(P>0.05)。结论miR-29a在脓毒症患者外周血中呈高表达状态,其能够通过抑制STAT3的表达削弱IL-10对单核细胞的保护作用,从而促进细胞凋亡的发生以及抑制细胞增殖。