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实验目的血清学定义的结肠癌抗原3(Serologically defined colon cancer antigen-3,Sdccag3)作为一种内体蛋白,在细胞骨架重塑、纤毛发生、蛋白转运、有丝分裂、细胞凋亡等生物学行为中发挥重要作用,但其在种植体骨结合的作用尚不明确。高脂血症,一种以血清中脂质代谢水平升高为特征的代谢性疾病,其升高的血脂水平抑制成骨分化,导致骨改建不良,而成为影响骨结合的危险因素,影响高脂血症缺牙患者种植治疗的成功率和远期疗效。近年来一些研究表明,单纯的控制感染和炎症并不能解决种植术后种植体骨结合失败的问题,种植体周围基因调控网络亦发挥重要作用。围绕以上问题,本课题组前期实验通过对高脂血症大鼠及正常大鼠种植体周围骨组织进行RNA测序分析,发现了与Sdccag3明显相关的非编码RNA(noncoding ribonucleic acids,ncRNAs),即长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)lncRNA-MSTRG.97162.4、非编码小 RNA(MicroRNA,miRNA)miR-193a-3p。因此,本实验旨在通过构建Sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p过表达/抑制表达慢病毒载体,应用micro-CT及骨小梁相对体积(Percent trabecular area,BV/TV)分析、HE染色及骨-种植体结合率(bone-implant combination ratio,BIC%)分析、实时定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western blotting等实验技术,从体内实验水平进一步阐明Sdccag3及其相关lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p对高脂血症大鼠种植体骨结合的作用机制,以期为治疗高脂血症引发的骨质疏松、骨结合不良等临床问题提供新方法。实验方法(1)80只4周龄成年雄性Wistar大鼠,其中24只随机均分为高脂组和正常组,分别给予高脂饮食和普通饮食;56只给予高脂饮食。8周后,所有高脂喂养的大鼠内眦静脉取血,检测血脂水平,以确认高脂血症实验大鼠模型成功建立。(2)12只高脂组和12只正常组大鼠于距双侧股骨干骺端远心端5mm处植入长度2.5mm、直径1.5mm的纯钛种植体各一枚,并于术后2周、4周获取种植体周围约1mm的骨组织。(3)分 别 构 建 Sdccag3-enhancer、Sdccag3-inhibitor、lncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer、miR-193a-3p-enhancer、miR-193a-3p-inhibitor 及 LV17-nc、LV16-nc 慢病毒载体。(其中 LV17-nc 为Sdccag3-enhancer、1ncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer 的阴性对照组;LV16-nc为 Sdccag3-inhibitor、miR-193a-3p-enhancer、miR-193a-3p-inhibitor 的阴性对照组。)(4)56 只高脂血症实验大鼠分组随机分为 Sdccag3-enhancer组、lncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer 组、LV17-nc 组,Sdccag3-inhibitor 组、miR-193a-3p-enhancer 组、miR-193a-3p-inhibitor 组、LV16-nc 组,每组各 8只;于种植术前3、0天于种植体植入部位肌肉注射相应慢病毒载体;术后2周获取种植体周围约1mm的骨组织。(5)Micro-CT对所取部分样本进行扫描,并行BV/TV分析及三维重建,观察种植体周围0.5mm新骨形成情况。对扫描后的样本固定包埋,制作硬组织切片并行苏木素-伊红染液染色,观察种植体-骨界面新骨形成及骨小梁排列情况;Image-Pro Plus 软件行 BIC%分析。(6)qRT-PCR 检测 Sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p 及成骨基因Runx2的表达水平;Western blotting检测Sdccag3、Runx2蛋白的表达水平。(7)采用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行处理,行统计学分析。具体实验流程如下:#12实验结果(1)高脂血症实验大鼠血清中的脂质水平明显高于正常组(P＜0.05),高脂血症大鼠模型成功建立。(2)与正常组大鼠相比,高脂血症实验大鼠BIC%、BV/TV降低(P＜0.05),骨小梁排列稀疏,新骨生成减少。(3)与 LV17-nc 组相比,Sdccag3-enhancer 组 BIC%、BV/TV 升高(P＜0.05),骨小梁排列致密,新骨生成增加;Sdccag3、IncRNA-MSTRG.97162.4、Runx2的表达升高(P＜0.05),miR-193a-3p 的表达降低(P＜0.05);Sdccag3、Runx2蛋白表达水平升高。而与LV16-nc组相比,Sdccag3-inhibitor组BIC%、BV/TV降低(P＜0.05),骨小梁排列稀疏,新骨生成减少;Sdccag3、IncRNA-MSTRG.97162.4、Runx2 的表达降低(P＜0.05),miR-193a-3p 的表达升高(P＜0.05);Sdccag3、Runx2蛋白表达水平降低。(4)与 LV17-nc 组相比,IncRNA-MSTRG.97162.4-enhancer 组 BIC%、BV/TV升高(P＜0.05),骨小梁排列致密,新骨生成增加;lncRNA-MSTRG.97162.4、Sdccag3、Runx2 的表达升高(P＜0.05),miR-193a-3p 的表达降低(P＜0.05);Sdccag3、Runx2蛋白表达水平升高。(5)与 LV16-nc 组相比,miR-193a-3p-enhancer 组 BIC%、BV/TV 降低(P＜0.05),骨小梁排列稀疏,新骨生成减少;miR-193a-3p的表达升高(P＜0.05),Sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、Runx2 的表达降低(P＜0.05);Sdccag3、Runx2 蛋白表达水平降低。miR-193a-3p-inhibitor 组 BIC%、BV/TV 升高(P＜0.05),骨小梁排列致密,新骨生成增加;miR-193a-3p的表达降低(P＜0.05),Sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、Runx2 的表达升高(P＜0.05);Sdccag3、Runx2 蛋白表达水平升高。结论(1)高脂血症实验大鼠种植体骨结合不良。(2)①Sdccag3促进高脂血症实验大鼠种植体骨结合,并可正性调控lncRNA-MSTRG.97162.4的表达,负性调控miR-193a-3p的表达;②lncRNA-MSTRG.97162.4促进高脂血症实验大鼠种植体骨结合,并可正性调控Sdccag3的表达,负性调控miR-193a-3p的表达;③miR-193a-3p抑制高脂血症实验大鼠种植体骨结合,并可负性调控Sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4的表达。(3)Sdccag3、lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p 存在网络式的调控关系,并在高脂血症实验大鼠种植体骨结合中发挥重要作用,有望成为提高高脂血症种植体成功率的靶点。