【摘 要】
：
禽流感（avian influenza,AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）引起的禽类烈性传染病,不仅给国际养禽业造成了巨大的经济损失,同时也对人类公共卫生造成重大影响。犬肾细胞（MDCK）作为流感病毒易感细胞,普遍被用于疾病发病机理研究及疫苗研发,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对细胞进行改造,可以提高细胞的增毒能力并实现病毒在细胞培养系统中连续稳定的
论文部分内容阅读
禽流感（avian influenza,AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）引起的禽类烈性传染病,不仅给国际养禽业造成了巨大的经济损失,同时也对人类公共卫生造成重大影响。犬肾细胞（MDCK）作为流感病毒易感细胞,普遍被用于疾病发病机理研究及疫苗研发,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对细胞进行改造,可以提高细胞的增毒能力并实现病毒在细胞培养系统中连续稳定的增殖。天然免疫系统在机体抵抗病毒侵袭过程中发挥着重要作用,IFN-β1在禽流感病毒感染MDCK细胞的过程中诱发激活宿主天然免疫信号通路,对病毒增殖的多个过程产生干扰,并且释放到胞外的IFN-β1能进一步抑制禽流感病毒在细胞间的传播。BST2通过将细胞膜连接到病毒包膜,阻止病毒感染细胞后的出芽来抑制病毒的逆转录,还可以引起促炎细胞因子和I型IFN的上调,激发酶促反应进一步阻止病毒复制和扩散。本实验通过构建CRISPR/Cas9基因编辑系统,对MDCK细胞进行基因编辑,实现了MDCK细胞IFN-β1、BST2基因的敲除,通过检测MDCK细胞应对AIV的天然免疫信号传递通路中的关键因子,分析构建sg RNA文库并对MDCK细胞进行基因文库的编辑。对获得的不同单克隆细胞系通过实验检测生长能力和病毒增殖水平。本研究主要结果如下:（1）成功构建CISPR/Cas9系统,利用此技术对MDCK细胞进行IFN-β1基因的敲除,确定19个阳性细胞克隆,PCR实验和目的片段测序结果显示,在备选克隆中IFN-β1基因的两个靶向切割位点处出现了大片段的缺失或者大片段的随机插入,说明对MDCK细胞进行IFN-β1基因序列的编辑改造是有效的。通过选取细胞生长速率快的克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16并以这5株细胞克隆进行禽流感病毒的增殖比较试验,其中细胞克隆1表现出最好的病毒增殖效果,H9亚型禽流感病毒JS02株在该细胞克隆中获得连续增殖的能力,HA效价逐步升高并维持在最高的增殖水平。（2）对MDCK细胞中BST2基因进行编辑并通过筛选得到单细胞克隆,通过PCR实验筛选得到在靶向基因切割位点处出现片段缺失的MDCK-BST2-KO单克隆细胞。CCK8实验结果表明MDCK-BST2-KO细胞与母细胞相比增殖能力无差异;RT-PCR实验显示MDCK-BST2-KO细胞中BST2和IFN-?表达量均低于母细胞;通过慢病毒转染获得BST2过表达和回补表达细胞系,免疫荧光实验结果显示,在H9亚型禽流感病毒作用下不同细胞中BST2的表达量不同,并且病毒在细胞连续增殖后MDCK-BST2-KO细胞中HA效价最高,表明在MDCK细胞中BST2对JS02株AIV增殖有限制作用。（3）通过RT-PCR实验对MDCK细胞为抵抗AIV侵袭产生的免疫应答作用过程中相关的84个基因的表达变化进行检测,显示在感染后24小时内,35个基因显著上调,28个基因在12h达到最强。通过基因本体论和KEGG分析表明,AIV感染的MDCK细胞中最重要的参与途径是NF-κB和TNF信号传导途径,细胞因子-细胞因子受体相互作用以及PAMPs等信号通路。对MDCK细胞进行基因文库的编辑,筛选得到单细胞克隆,发现当细胞抗病毒免疫通路中的基因被敲除时,细胞的生长能力和病毒增殖效果存在差异。综上所述通过研究免疫系统与病毒的相互作用机理,对细胞进行改造可以提高细胞的增毒能力,并实现病毒在细胞培养系统中连续稳定的增殖。对细胞免疫应答通路中基因的改造,可为更好的了解宿主对病毒的拮抗作用,构建和筛选优质生产疫苗MDCK细胞株提供可靠依据和新思路。
其他文献
西藏地域辽阔、气候类型多样,蕴藏着丰富的植物资源,被誉为植物资源宝库。在藏东南有韭菜野生居群（木许居群、曲孜卡居群、绕金居群）分布,将其引种至林芝市巴宜区并开展初步研究后发现,这些资源在很多性状中表现出一定的差异,尤其在抽薹开花期方面差异巨大。因韭菜的抽薹、开花、结实会对韭叶产量造成一定影响,故培育迟抽薹韭菜品种对韭菜生产具有积极意义,但目前鲜见迟抽薹韭菜品种的报道。因此,在已有研究基础上对其元素
党的十九大提出实施乡村振兴战略,这是加快农村发展、改善农民生活、增加农民收入、推动城乡一体化的重大战略;这其中推动农民增收是关键。在此背景下,如何促进工布地区农民持续较快的增收具有重要的理论价值和实现意义。本文使用采取随机抽样方法,在2019年5月和10月,对工布地区的兼业农民和参与旅游业的个体经营户展开了实地调查。基于实地统计数据,依托结构方程模型,研究发现:（1）内在素质和农民增收之间的标准化
DPMS公司SASS半自动狙击步枪在美国很多特警和执法机构中都有装备,曾经是2012年加拿大一美国警察射击竞赛的狙击手指定用枪。GⅡ SASS 7.62mm口径狙击步枪,是该公司推出的第二代轻量型半自动狙击步枪,较上一代狙击步枪减轻了30%的质量。枪管采用416不锈钢制成,外部设有直线形散热槽,表面覆有特氟龙涂层,口部安装带攻击头的消焰器。上下机匣均采用7075-T6铝合金材料制成,弹匣插槽
西藏地处高海拔地区,区内分布着大量冰川,地质结构复杂,降雨在时空分布上极其不均匀,降雨引发的泥石流、滑坡、塌方等自然灾害具有极大的破坏力。渗透破坏是引发地质灾害的主要因素,所以研究土体的渗流特性和渗透机理以及计算方法具有重要的意义。粗粒土因其具有透水性强、抗渗性能低、沉降变形小等特性,常常作为高层建筑填料、坝体（壳）材料、防渗体材料等被广泛应用于道路、边坡工程、土石坝、水利工程等实际工程中,与此同
在发展水平较低的城市化初始阶段,对于国家或区域来说,乡村旅游业的发展对于当地经济、环境甚至社会文化都有着举足轻重的影响。按照目前的发展态势来看,不同国家或区域,正在尝试“复合”乡村旅游新模式,即“纵向多业态开发（协同挖掘乡村生态、人文等资源）+横向可持续发展（大开发的前提是保护）”。独辟蹊径和百花齐放,俨然成为了目前农业和旅游业发展的新特征和新方向。近年来,随着国内外学者对乡村旅游的深入研究,愈加
随着人们生活水平的提高和水资源污染的日趋严重,人们对供水的质量要求越来越高以及日益关注饮用水对健康的影响。因此对水源地水质展开评价和进行饮水对健康影响的研究显得尤其重要,这不仅可以给水源地管理和维护提供决策依据,还能为保障饮水卫生安全提供基础资料,是改善水源地水质现状和人们饮水健康的重要举措。由于目前我国水资源环境污染较为严重,在一定程度上威胁饮用水源地水质安全。为了更准确地了解林芝市县级以上水源
本研究以西藏4种铁线莲属（Clematis）植物西藏铁线莲（C.tenuifolia）、甘青铁线莲（C.tangutica）、合柄铁线莲（C.connata）、绣球藤（C.montana）为研究对象,通过种子形态特征、植株各器官含水量及生物量测定、植物光合特性、干旱胁迫下植物生理响应和内源激素变化等方面的实验,对西藏4种铁线莲的生态适应性进行了研究。研究结果如下:（1）种子大小、形态特征对植物种子
猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）的临床感染率较高,常存在于猪的鼻腔、气管和支气管的分泌物中,在特定情况下可引起猪多发性浆膜炎、关节炎、肺炎以及中耳炎等慢性炎症的发生,继而导致猪的生产性能下降。同时,Mhr还能感染人类,与胃癌、前列腺癌等多种癌症的发生发展相关Mhr也是细胞培养中比较常见的污染物之一。本研究主要对Mhr的人工发病模型及3-磷酸甘油醛脱氢酶在Mhr感染致病
草地畜牧业是西藏经济发展的支柱型产业,关系农牧民的衣食住行,而草地的利用方式关系着畜牧业能否持续健康的发展。墨竹工卡社区处于半农半牧的墨竹工卡县扎西岗乡境内,该社区牧民采用传统粗放型放牧模式,以放牧利用为主,没有投入性的管理措施,草场过牧较为严重,从而导致社区的草场退化,生物多样性减少,严重影响该社区的可持续发展。为了更合理的利用天然草地,维持草畜平衡,减缓草地退化,需要对社区放牧模式进行优化。本
小菜蛾（Plutellda xylostella L.）主要危害十字花科蔬菜。小菜蛾繁殖能力强,生活周期短,世代较多,分布于世界各地,是世界性的害虫。在农业上以化学防治为主,由于常年大量使用同种药剂,造成小菜蛾抗性快速发展,防控比较困难。西藏地区十字花科蔬菜的种植量大,小菜蛾发生普遍且严重,但对小菜蛾的抗性程度尚不明确。本次研究采用叶片浸药法对西藏6个地点的小菜蛾田间种群进行常用药剂的抗性测定,并